Ansiedlungsversuche von humanen Fibrochondrozyten auf biokompatiblen, dreidimensionalen Trägermaterialien

Abstract

Da das Kniegelenk einer hohen mechanischen Belastung ausgesetzt ist, sind Schäden des Meniskus von hoher klinischer Relevanz und begünstigen das Entstehen einer Gonarthrose. Aufgrund der mangelnden Fähigkeit zur endogenen Heilung von Meniskus-Traumata sollten in diesem Projekt verschiedene Trägermaterialien für Meniskuszellen (Fibrochondrozyten) erprobt und ein Verfahren für die Übersiedlung der Zellen auf diesen Materialien entwickelt werden, um in Zukunft mittels Tissue-engineering Meniskusschäden therapieren zu können. Aus intraoperativ gewonnenen Menisci wurden Zellkulturen angelegt. Nach Bildung eines dichten Zellrasens wurden die Zellen charakterisiert und auf die Trägermaterialien (Kollagenvlies Pelvicol, kollagenes Meniskusersatzimplantat CMI, polymere Vliese PLLA und LG9010) übersiedelt. Die Übersiedlung erfolgte, indem die Trägermaterialien für 3h in eine hochkonzentrierte Suspension bestehend aus Nährmedium und o.g. Fibrochondrozyten eingelegt wurden. Der Besiedlungserfolg wurde mit Hilfe HE-gefärbter Paraffinschnitte der Materialien zum Zeitpunkt t15 Tage und t30 Tage nach Übersiedlung evaluiert. Parallel wurden zum Zeitpunkt t0 Tage, t15 Tage und t30 Tage nach Übersiedlung Zellcharakterisierungen mittels RT-PCR (t0 Tage: Koll. I und II, MMP 1, 2, 3 und 8, IL-1, -6, -18, TGFβ1, BMP2, iNOS) und Immunhistochemie (t0 Tage: Koll. I, II, III und VI, MMP 1, 3 und 8, AS02, iNOS, IL-1RA; t15 Tage, t30 Tage: Koll. I, II, III und VI, MMP 1, 3und 8) sowie eine Alzianblaufärbung (t15 Tage, t30 Tage nach Übersiedlung) durchgeführt. Nach durchschnittlich 46,83 Tagen Vorkultur standen ausreichend viele Zellen für die Hauptversuche zur Verfügung. Nach den Ergebnissen der Zellcharakterisierung zum Zeitpunkt t0 Tage wiesen die Zellen nach der Vorkultur keine Zeichen für Dedifferenzierung/Entartung auf. Lichtmikroskopische Beobachtungen der Polymervliese in vitro direkt nach der Übersiedlung zeigten, dass die gewählte Übersieldungmethode effektiv war. Die HE-Färbungen der Paraffinschnitte bestätigte dies sowohl bezüglich der Zelldichte als auch –verteilung auf den Trägermaterialien. Die Ausnahme stellte CMI dar, auf dem keine Zellen nachgewiesen werden konnten. Von t15 Tage auf t30 Tage konnte jedoch lediglich bei den Pelvicol-Vliesen eine geringe Erhöhung der Zelldichte beobachtet werden, auf den Polymer-Vliesen war dies praktisch nicht der Fall. Auch bezüglich des Synthesemusters der Zellen schien Pelvicol als Trägermaterial überlegen zu sein. Dies zeigte v.a. der Nachweis der Koll. I- und Mukopolysaccharid-Synthese (Alzianblaufärbung) der Zellen auf Pelvicol-Vliesen im Gegensatz zu Zellen auf Polymer-Vliesen. Die Studie hat gezeigt, dass sich Meniskuszellen zellkulturell züchten und charakterisieren lassen. Die Übersiedlungsmethode, die Trägermaterialien in einer hochkonzentrierten Zell-Mediumsuspension zu inkubieren erwies sich für PLLA, LG9010 und Pelvicol als erfolgreich, auf CMI wuchsen sie nicht an. Aufgrund Zellvermehrung/-verteilung und Synthesemuster der Zellen war Pelvicol das geeignetste Material. Weitere Studien werden sich mit der Optimierung des Übersiedlungszeitpunktes und der Kulturbedingungen (Bioreaktoren) beschäftigen müssen, um das Proliferations- und Syntheseverhalten der Zellen positiv zu beeinflussen.

meniscal injuries are of high clinical relevance and favour the developement of gonarthrosis. Because of the small capability of endogene healing, the procedure of seeding meniscal cells on different scaffolds, which had to be tested, should be developed in this project, in order to find a tissue-engineering associated therapie for meniscal injuries in the future. After cell culture the meniscal were characterized and seeded on different scaffolds (Pelvicol, CMI, PLLA, PLGA) by putting them into a high concentrated suspension of medium and cells. Success was evaluated at day 15 and 30 by producing paraffine sections and HE-treatment, parallele cell characterizations happend at day 0, 15 and 30 via PCR and immunhistochemistry. At day 0, there were no signs of dedifferentiation. The chosen process of seeding was succesful, as lightmicroscopial observations showed. Density and distribution of cells on the scaffolds showed this as well, as seen on paraffine-sections, except on CMI, where ther were no cells found. From day 15 to day 30, only on Pelvicol there was a small increase. Also concerning the pattern of synthesizis, Pelvicol was superior. The project showed that meniscal cells can be cultured and characterized. Seeding was succesful, too, especially for the Pelvicol-scaffold. Future-project will have to deal with the right time of seeding and the improvement of culture-conditions.