Modulation der Bindung von KATP-Kanalliganden an rekombinante Sulfonylharnstoffrezeptoren durch Oleoyl-Coenzym A

Abstract

ATP-abhängige K+-Kanäle (KATP-Kanäle) sind Komplexe aus einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanälen (KIR6.1 oder KIR6.2) und Sulfonylharnstoffrezeptoren (SURs). KIR6.2-enthaltende Kanäle werden durch die Bindung von ATP an die Untereinheit KIR6.2 geschlossen, wohingegen die MgADP-Bindung am SUR eine Kanalöffnung bewirkt. Die Kanalaktivität wird moduliert durch synthetische Verbindungen wie die beim Diabetes mellitus eingesetzten, kanalblockierenden Sulfonylharnstoffe und die KATP-Kanalöffner (z.B. P1075, Diazoxid und Minoxidil). Öffner und Blocker binden beide an den SUR. Membranphospholipide wie PIP2 und langkettige Acyl-Coenzym A-Ester wie Oleoyl-CoA interagieren mit der KIR6.2-Untereinheit und vermindern im physiologischen Konzentrationsbereich (10 -6 bis 10 -5 mol/l) die ATP-Empfindlichkeit der Kanäle. Sie sind daher wichtige natürliche Kanalmodulatoren. Synthetische Modulatoren wie Sulfonylharnstoffe (z.B. Glibenclamid [GBC]), P1075 und Diazoxid werden durch die genannten Lipide in ihrer Wirkung auf die Kanäle aufgehoben. In vorangehenden Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe beobachtete man bei hohen Lipidkonzentrationen (>= 1-10 µM) ebenso eine Hemmung der Bindung der Kanalmodulatoren an die verschiedenen SUR-Subtypen (SUR1, SUR2A, SUR2B, SUR2A(Y1206S)). Dabei entfaltete Oleoyl-CoA die größte Wirkung und konnte die Bindung vollständig hemmen. Aufgrund dieser Beobachtungen sollte in der vorliegenden Arbeit die Wirkung des Oleoyl-CoA an den SUR-Subtypen genauer untersucht werden, vor allem hinsichtlich des jeweiligen Hemmechanismus. Hierzu wurden Radioligandbindungsstudien an rekombinanten SUR-Subtypen in HEK-Zellmembranen bei 37°C durchgeführt, in denen der Einfluß von Oleoyl-CoA auf die 3H-P1075-Bindung an SUR2A und SUR2A/KIR6.2 (KATP-Kanal im Herz- und Skelettmuskel) und die 3H-GBC-Bindung an SUR1 (Kanal in Pankreas und Neuronen) und SUR2A(Y1206S) (Mutante) untersucht wurde. An SUR1/SUR2A konnte für die Interaktion von Oleoyl-CoA mit 3H-GBC/3H-P1075 ein überwiegend kompetitiver Inhibitionsmechanismus gezeigt werden mit Gleichgewichtsdissoziationskonstanten KO für Oleoyl-CoA von 3/14 µM. Die Anwesenheit von MgATP bei SUR1 und die Koexpression von SUR2A mit KIR6.2 reduzierte den Hemmeffekt des Lipides. Die IC50-Werte sämtlicher Oleoyl-CoA-Hemmkurven lagen im Bereich von 6 bis 44 µM. Steigende Konzentrationen des Radioliganden bewirkten in allen Fällen entsprechend dem kompetitiven Hemmechanismus eine vollständige Antagonisierung der Lipidhemmung. Geringe Konzentrationen an Oleoyl-CoA (0.01-1 µM) verursachten eine schwache Stimulation der 3H-GBC-Bindung an die Mutante SUR2A(Y1206S). Dieser Effekt war jedoch zu variabel, um weiter untersucht werden zu können. Die Daten zeigen, daß Oleoyl-CoA nur bei hohen Konzentrationen mit dem SUR interagiert und die Bindung von Glibenclamid und P1075 hemmt. Die dazu benötigten Lipidkonzentrationen sind um den Faktor 10-100 höher als die für Effekte am KIR6.2 benötigten Konzentrationen. Die Bindung von Oleoyl-CoA an die verschiedenen SUR-Subtypen ist daher von geringer physiologischer Relevanz. Jedoch sollte bei Untersuchungen zur Wirkung von Sulfonylharnstoffen und Öffnern am KATP-Kanal in Anwesenheit von Lipiden wie Oleoyl-CoA deren Konzentration berücksichtigt werden, da hohe Lipidkonzentrationen (>= 1-10 µM) die Bindung von Kanalmodulatoren beeinflussen.

ATP-sensitive K+ channels (KATP channels) are complexes of inwardly rectifying K+ channels (KIR6.1 or KIR 6.2) and sulphonylurea receptors (SUR). Channels containing KIR 6.2 are closed by ATP binding to KIR 6.2, and opened by MgADP binding to SUR. Channel activity is modulated by synthetic compounds such as the channel-blocking sulphonylureas used in therapy of diabetes and the KATP channel openers (e.g. P1075, diazoxide, minoxidil), which both act by binding to SUR. Membrane phospholipids such as PIP2 and long-chain acyl-CoA-esters such as oleoyl-CoA bind to KIR 6.2 and reduce the ATP-sensitivity of the channels at physiological concentrations (10 -6 to 10 -5 mol/l). Thus, lipids are important and naturally occuring modulators of KATP channels. Moreover, they abolish the effects of the synthetic channel modulators (e.g. the channel closing sulphonylureas such as glibenclamide [GBC] and the KATP channel openers [P1075, diazoxide]). Work in a former thesis showed that the binding of channel modulators to various SUR subtypes (SUR1, SUR2A, SUR2B, SUR2A(Y1206S)) is inhibited at high concentrations of lipid (>= 1-10 µM). Oleoyl-CoA is the most potent lipid and inhibits binding completely. According to these findings we further examined the effect of oleoyl-CoA binding to SUR subtypes. To this end radioligand binding studies were made with membranes of HEK cell lines stably expressing SUR subtypes at a temperature of 37°C. We examined the effect of oleoyl-CoA on binding of 3H-P1075 to SUR2A and SUR2A/KIR 6.2 (KATP channel in heart and skeletal muscle) and binding of 3H-GBC to SUR1 (channel in pancreas and neurons) and to the mutant, SUR2A(Y1206S). As to SUR1/SUR2A, the interference of oleoyl-CoA with 3H-GBC/3H-P1075 binding showed a predominantly competitive mechanism of inhibition with an equilibrium dissociation constant for oleoyl-CoA (KO) of 3/14 µM. With SUR1, the inhibitory effect of the lipid was decreased by the presence of MgATP. In addition, coexpression of SUR2A with KIR 6.2 reduced the oleoyl-CoA-effect. All inhibition curves showed values of IC50 ranging from 6 to 44 µM. Inhibition was reversed by increasing the concentration of the respective radioligand in agreement with an essentially competitive mechanism. At low concentrations of oleoyl-CoA (0.01-1 µM), there was a modest stimulation of 3H-GBC binding to the mutant SUR2A(Y1206S). However, this effect was too small to allow further characterisation. Our studies demonstrate that oleoyl-CoA, at high concentrations, interacts with SUR in a specific manner and inhibits the binding of glibenclamide and P1075. The concentrations of lipid needed to bind to SUR are 10-100 x higher than those needed to interfere with KIR 6.2. Thus, binding of oleoyl-coA to SUR subtypes is of little physiological importance. It is, however, of pharmacological importance and must be taken into account if high concentrations of lipid compounds (e.g. oleoyl-coA >= 1-10 µM) are used to interfere with the actions of sulphonylureas and openers on KATP channel activity.