Etablierung von Home-Made cDNA Microarrays und Untersuchung der Genexpression nach Hochleistungssport

Abstract

Stress kann in verschiedenen Varianten auftreten, und sich sehr unterschiedlich auf den Organismus auswirken. Im Rahmen dieses Forschungsprojektes wurde ein freiwillig auferlegter physischer Stress in Form von Hochleistungssport untersucht. Bei hohen Trainings- oder Wettkampfbelastungen werden Stressantworten im Immunsystem des Sportlers mobilisiert, die dann sekundäre Auswirkungen auf somatische Parameter zeigen. Diese Auswirkungen können zu Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung im peripheren Blut führen. Des Weiteren, kann man eine Veränderung auf Genexpressionsebene beobachten. Im Rahmen der Dissertationsarbeit wurden home-made cDNA Microarrays hergestellt und etabliert. Die Herstellung und Etablierung sind im Abschnitt Methode dieser Arbeit ausführlich beschrieben. In dieser Studie wurde mit home-made cDNA Microarrays die Genexpression bei acht Halbmarathonläufern untersucht. Der eingesetzte cDNA Microarray enthielt ausgewählte Gene des Stress- und Entzündungsgeschehen. Das Besondere dieses Ansatzes ist, dass nicht nur ein einzelnes oder wenige Kandidatengene sondern eine größere Gruppe potentiell relevanter Gene auf mRNA- Ebene analysiert wurde. Die Abnahmezeitpunkte der Blutproben der Läufer waren, vor (t0), unmittelbar nach (t1) und 24 Stunden nach (t2) einem Halbmarathonlauf. Die hier gefundenen signifikant exprimierten Gene wurden mittels Real Time PCR bestätigt. Lineare Regressions-Auswertungen zeigten, dass Microarray-Expressionsanalysen von zelltypischen Oberflächen-Molekülen die beobachtete Zellveränderung im peripheren Blut mit hoher Signifikanz wiederspiegeln. In Übereinstimmung mit Ergebnissen vorheriger Studien, konnte eine erhöhte Regulation von MAPKAP-K2, L-Selectin und IL1-ra nach Hochleistungssport nachgewiesen werden. Die Hauptergebnisse dieser Studie zeigen zum ersten Mal die verringerte Expression von CD81, die erhöhte Expression von Thioredoxin, welches wohlmöglich eine wichtige Rolle in der antioxidativen Abwehr spielt, und erstaunlicherweise die verminderte Expression des Antikarzinogenen-Gens GSTM3 im peripheren Blut. Ein weiteres Ziel dieser Studie war die Erstellung eines genetischen Expressions-Fingerabdrucks bei einem Halbmarathonlauf. Die Verteilung der identisch regulierten Gene zu einem bestimmten Zeitpunkt, bzw. körperlichen Zustand, ergibt ein für diesen Moment spezifisches Muster. Dieses für den bestimmten Zeitpunkt typische Muster wird als „genetischer Expressions-Fingerabdruck“ bezeichnet. Bei der Analyse der Daten wurden alle auf dem Microarray vorhandenen Gene bei allen acht Läufern nach ihrer identischen Veränderung der Genexpression zwischen den einzelnen Entnahmezeitpunkten eingeteilt. Im Vergleich t1 mit t0 konnten 36 identisch exprimierte Gene gefunden werden. 21 Gene waren beim Vergleich zwischen t2 und t0 bei allen acht Läufern identisch exprimiert. Diese gefundenen Muster für die jeweiligen Entnahmezeitpunkte könnten einen für diesen Zeitpunkt typischen genetischen Expressions-Fingerabdruck bei Halbmarathon darstellen. Die identisch regulierten Gene waren den folgenden Gruppen bezüglich ihrer physiologischen Funktion zugeordnet: Signaltransduktion, Membranproteine, Zellinteraktionen, Apoptose, anti-/ oxidatives System, Immunsystem und anti-/ inflammatorisches System. Die Studie zeigt, dass Untersuchungen der Expressions-Fingerabdrücke und der Genexpression mit cDNA Microarrays eine verlässliche und präzise Methode ist, um die Liste der Kandidatengene, deren Regulation im Zusammenhang mit Hochleistungssport nachgewiesen werden kann, zu vervollständigen. Dies wird helfen, die Vorgänge bei Stress, Stressbewältigung, Adaption und Übertraining besser zu verstehen. Fernziel ist die Erstellung eines optimalen Werkzeuges für Trainingssteuerung und Stressdiagnostik im Allgemeinen.

It is generally accepted that exhausting endurance exercise exhibits strong effects on the immune system. Such effects have been attributed to changes in the cellular composition of peripheral blood, as well as to changes in the expression of plausible candidate genes. The list of candidate genes is far from being complete, since this issue has not yet been investigated in a systematic way. In this context we used a home-made cDNA microarray focused on inflammation as a screening approach to study gene expression in eight half-marathon runners before (t0), immediately after (t1) and 24h after exercise (t2). Significant differential gene expression was verified by quantitative Real Time PCR. The production and the establishing of microarrays are described in detail in Material and Methods of this dissertation. Linear regression analysis showed that microarray expression analysis of cell type specific surface molecules reflects the observed individual cellular shifts in peripheral blood cells with high statistical significance. In line with the results of former studies, we observed an up-regulation of MAPKAP-K2, L-selectin and IL1-ra after exhaustive exercise. The main results of this study report for the first time the down-regulation of CD81, the up-regulation of Thioredoxin, which may play an important part in anti-oxidative defence, and, surprisingly, the down-regulation of the anti-carcinogenic gene GSTM3 in peripheral blood. The study shows cDNA microarray expression analysis as a reliable systematic instrument to complete the list of candidate genes which may play a role in exhaustive exercise induced modulation of the immune response. A further aim was to obtain a molecular fingerprint of gene expression in response to sustained exercise. We wanted to find a pattern of genes that was regulated similarly in all eight athletes. Comparing t0 vs. t1, and t0 vs. t2, 36 and 21 sequences respectively, showed a consistent pattern of changes in all eight athletes. The pattern of these modified genes can be viewed as a “gene expression fingerprint” for each time point in response to a half marathon. These genes are associated with signal transduction, membrane proteins, cell interaction, apoptosis, anti-/ oxidative system, immune system and anti-/ inflammation processes. The known and novel genes identified here represent targets for further molecular characterization of the complex reaction of the body to an exhaustive challenge. In general, gene expression profiling can help to characterize tissues or diseases, may give hints for special therapies and may serve in the future as a powerful research tool in exercise.