Nachweis von E. coli aus Wasserproben durch in-situ-Hybridisierung und molekularbiologische Verfahren

Abstract

Die vorliegende Untersuchung zum Nachweis von E. coli aus Wasserproben durch in-situ-Hybridisierung erfolgte an Wasserproben aus Routineuntersuchungen des Instituts für Hygiene und Umwelthygiene der Universität Tübingen und selbstgewonnenen Wasserproben, die mit E. coli-Kulturen unterschiedlicher Konzentrationen versetzt waren. Diese Proben wurden mit Readycult(R), der FISH-Technik, der Mikrokolonie-hybridisierung und der Realtime-PCR mit dem LightCycler(R) auf E. coli untersucht. Die Readycult(R)-Methode, welche auf der X-GAL Reaktion und der MUG-Reaktion beruht - mit der einerseits Gesamtcolifome und andererseits E. coli nachgewiesen werden können – zeigte, daß nach 24 Stunden ein 100 prozentiger Nachweis von E. coli möglich ist, soweit diese E. coli-Stämme das Enzym β-D-Glucuronidase besitzen (nur 97 %). Die FISH-Technik, mit der E. coli über speziell angefertigte Oligonucleotidsonden nachgewiesen wird, offenbarte ein Problem dieser Methode. Kleine Mengen von E. coli können erst nach Anreicherung in einem Kulturmedium (Lactose-Bouillon) nachgewiesen werden. Immerhin konnten nach 24 Stunden Voranreicherungszeit in 95 % der Proben E. coli nachgewiesen werden. Bei der Mikrokoloniehybridisierung erfolgt der Nachweis von E. coli über Membran-filter, durch die bestimmte Mengen der Wasserproben filtriert wurden, die danach auf Endo- oder Tergitolagar für abgestufte Zeiten inkubiert wurden. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Filter wie bei der FISH-Technik mit Oligonucleotid-sonden behandelt. Mit dieser Methode konnten allerdings nur in 4,7 % der Proben E. coli nachgewiesen werden. Eine stichprobenartige Untersuchung des Waschpuffers ergab eine unzureichende Adhärenz von E. coli an den verwandten Filtern. Bei der LightCyler(R) -PCR - die den Nachweis von E. coli über spezielle Gen-sonden, die an bestimmte Gensequenzen von E. coli binden, führt - ist es möglich geringste Mengen an Bakterien-DNA nachzuweisen (ca. 10 Kopien des Genoms sollten aber vorhanden sein). Ob es sich dabei um lebende Bakterien oder nur DNA-Bruchstücke handelt, kann hierbei nicht unterschieden werden. Bereits nach 4 Stunden Voranreicherungszeit in Lactose-Bouillon konnte eine Nachweisrate von 100 % erzielt werden. Somit ist die LightCycler(R)-Methode die schnellste und genaueste dieser Untersuchungsreihe. Die hier vorgestellten Verfahren können bisher nur als Ergänzung zu den gesetzlich vorgeschriebenen Methoden angesehen werden. Als schnelle Nachweis-Verfahren eignen sich besonders die Readycult(R)-Methode und die LightCyler(R)-PCR. Zur Beantwortung der gesetzlich gestellten Frage: E. coli in 100 ml Wasser vorhanden oder nicht, ist die Readycult(R)-Methode auf Grund ihrer einfachen Durchführbarkeit am ehesten geeignet. Kommt es allerdings auf die Schnelligkeit des Nachweises an und spielen die Kosten keine Rolle, kann heute eigentlich nur noch die Untersuchung mit einer LightCyler(R)-PCR empfohlen werden.

This report for the evidence of E. coli in water samples with in-situ-hybridization was made with water samples from routine inquiries of the Institut für Hygiene und Umwelthygiene der Universität Tübingen and also independently taken water samples, which were contaminated with E. coli cultures in different concentrations. These samples were tested for the presence of E. coli using Readycult(R), the FISH–technique, the microcolony hybridization and a Realtime-PCR with the LightCycler(R). The Readycult(R)-method - based on the X-Gal-reaction and the MUG-reaction – allows on the one hand the detection of total coliforms and on the other hand the detection of E. coli. The Readycult(R)-method showed a 100 % confirmation of E. coli after 24 hours (only 97 % of E. coli strains contain an enzyme for the 4-methylbelliferyl-beta-D-glucuronide (MUG) enzyme reaction). The FISH-technique which uses specially designed oligonucleotid probes showed a problem of this method. Small amounts of E. coli can only be detected after cultivation in a lactose broth. After a period of 24 hours the detection of E. coli was possible in 95 % of the samples. For the detection of E. coli with the microcolony hybridization a certain amount of the water samples were filtrated through membrane filters. After incubation they were examined in the same way as it was done with the FISH-technique. The detection of E. coli was only possible in 4.7 % of the probes. A random test of the washing buffer showed insufficient adherence to the used membrane filters. With the LightCycler(R)-PCR - which uses specially designed gene probes binding with specific gene sequences - it is possible to detect very small amounts of bacterial DNA (10 genome copies should be present). There is no way of distinguishing between viable bacteria and DNA-fragments. Incubation for 4 hours in a lactose broth showed an evidence rate of 100 %.Thus the LightCycler(R)-method is the fastest and exactest of this study. The methods described in this thesis can only be regarded as a amendments to the methods required by law. Especially the Readycult(R)-method and the LightCycler(R)-PCR are suitable for a quick detection. To answer the question stipulated by law, if E. coli is present in 100 ml water or not the Readycult(R)-method is the most suited and easiest way. If it depends on the quickness of detection and you spare no expense only the LightCycler(R)-PCR can be recommended today.