Der Einfluß der porenbildenden Untereinheit des KATP-Kanals auf die pharmakologischen Eigenschaften der Sulfonylharnstoffrezeptoren SUR1 und SUR2A(Y1206S)

Abstract

Der KATP-Kanal ist als Ansatzpunkt der Sulfonylharnstoffe und Glinide bekannt. Diese fördern durch Hemmung der Aktivität des Kanals in den beta-Zellen der Langerhans‘schen Inseln des Pankreas (Kir6.2/SUR1) die Insulinsekretion. Die KATP-Kanäle kommen in allen erregbaren Zellen vor und sind Oktamere aus vier einwärtsgleichrichtenden Untereinheiten der Familie Kir6.x (Kir6.1/Kir6.2) und vier Sulfonylharnstoffrezeptoren (SUR1/SUR2A/SUR2B). Gegenstand der Arbeit war, in 3H-Glibenclamid ([3H]GBC)-Verdrängungsversuchen die Bindung verschiedener Sulfonylharnstoffe und Glinide an die SUR-Subtypen SUR1 und SUR2A(Y1206S) vergleichend zu messen und den Effekt der Koexpression mit Kir6.2 zu erfassen. Damit sollte die Selektivität der Sulfonylharnstoff- und Glinid-Bindung an die physiologisch wichtigen Kanaltypen Kir6.2/SUR1 (Beta-Zellen, Pankreas, Neurone), Kir6.2/SUR2A (Herz- und Skelettmuskel), Kir6.1/SUR2B (Gefäßmuskulatur), Kir6.2/SUR2B (glatte Muskulatur) bestimmt und auch ein Teil des kardiovaskulären Risikopotentials der Substanzen erfasst werden. Durch Verwendung chemisch verschiedenartiger Substanzen, die an die Kompartimente A, B oder A + B der Bindungstasche des SUR gehen, wurden zugleich diese Bindungsstellen an den beiden SUR-Subtypen abgetastet ("Rezeptor Mapping"). Über die B-Seite ist nur wenig bekannt, außer dass die zytosolische Schleife 3 des SUR für die Bindung an dieser Stelle wesentlich ist. Der Effekt der Koexpression erlaubt Rückschlüsse auf die Kopplung zwischen Kir und SUR. Man weiß, dass auf Kir6.2-Seite die ersten 10-20 Aminosäuren des Aminoterminus für den sulfonylharnstoffinduzierten Kanalblock eine Rolle spielen (Reimann et al.,1999); über einen Einfluß auf die Bindung ist nichts bekannt. Die Messungen wurden unter möglichst physiologischen Bedingungen (intakte Zellen, glukosehaltiger Puffer) durchgeführt. Als wichtigstes Ergebniss wurde gefunden, dass die Koexpression mit Kir6.2 die Affinität von SUR1 und SUR2A(Y1206S) für Sulfonylharnstoffe und Glinide (ohne die Piperidino-Verbindungen) um einen Faktor 3.6 bzw. 7.9 erhöht. Der Unterschied zwischen den beiden SUR-Subtypen ist statistisch signifikant und zeigt, dass die Komplexierung mit Kir6.2 die Bindungstasche des SUR2A(Y1206S) für die Sulfonylharnstoffe und Glinide mehr verändert als die des SUR1. Weiterhin stellte sich heraus, dass die Piperidino-Verbindungen Repaglinid und (-)-AZ-DF265 am Stärksten auf die Koexpression reagieren. Dieser Effekt ist bei SUR1 wesentlich deutlicher als bei SUR2A(Y1206S). Der Piperidinrest ragt aus dem gemeinsamen Pharmakophor des B-Teils von Meglitinid heraus (Hansen et al.,Diabetes 2002) und macht offensichtlich einen Kontakt mit einer Region des Kir6.2/SUR-Komplexes, den alle anderen Verbindungen nicht machen. Die reinen Typ B-Verbindungen, wie z.B. Meglitinid, Repaglinid und (-)-AZ-DF265 binden an SUR1 und SUR2A(Y1206S) jeweils mit derselben Affinität. Dies gilt auch noch nach Koexpression mit Kir6.2, mit der Ausnahme von (-)-AZ-DF265, welches deutlich pankreasselektiv wird. Die Arbeit, deren erste Ergebnisse in Diabetes veröffentlicht wurden (Quast et al., Diabetes 53:Suppl. 3, S156-S164, 2004), zeigt erstmalig die Bedeutung der Koexpression mit Kir6.2 auf die Affinität des SUR für Sulfonylharnstoffe und Glinide und zeigt, dass dieser Effekt vom SUR-Subtyp abhängt.

Insulin secretagogues (sulfonylures and glinides) increase insulin secretion by closing the ATP-sensitive K+ channel (KATP channel) in the pancreatic membrane (Kir6.2/SUR1). KATP channels are composes of two types of subunits, inwardly rectifying K+ channels (Kir6.1/Kir6.2) and sulfonylurea receptors (SUR1/SUR2A/SUR2B), arranged as tetradimeric complexes, (Kir6.x/SURx)4. The Kir6.x subunits form the pore of the channel. Of particular importance are the KATP channels in pancreatic beta-cells (Kir6.2/SUR1), in cardiomyocytes (Kir6.2/SUR2A), in vascular myocytes (Kir6.1/SUR2B) and in smooth muscle cells (Kir6.2/SUR2B). A commonly accepted hypothesis postulates that the binding site of the channel blocking sulfonylureas (SUs) and glinides on SUR is composed of two subsites, A and B, leading to a classification of the blockers as type A (short SUs, e.g. nateglinid), type B (e.g. meglitinid, repaglinid, AZ-DF265) and type A+B ligands (long SUs). S1237 is important for binding to subsite A. Here we have mutated the corresponding amino acid of SUR2A, Y1206, to Ser and have studied the impact of this mutation on the binding affinities of the three ligand classes to Kir6.2/SUR2A and the effect of coexpression with Kir6.2 on their binding to SUR2A(Y1206S) in comparison with binding affinities to Kir6.2/SUR1. While severel drugs that have been developed to inhibit the channels act (mainly) via SUR it is known that the affinity of these compounds is increased in presence of Kir. In our study we compared this effect of coexpression with Kir6.2 for the binding of diffenent classes of inhibitors to SUR2A(Y1206S). We observed an especially strong increase in affinity for AZ-DF265 and repaglinide with both feature a certain piperidino moiety. The most important result is that the coexpression with Kir6.2 increase the affinity of SUR1 and SUR2A(Y1206S) for sulfonylureas and glinides (without the piperidino containing compounds ) 3.6x- 7.9x. The diffenence between the two SUR-types is statistical significant and shows that the coexpression with Kir6.2 has an stronger effect on the conformation of the binding pocket of SUR2A(Y1206S) for SUs and glinides than of SUR1. The strongest increasing of the affinity showed the coexpression with piperidino containing compounds repaglinide and AZ-DF265. This effect is higher for SUR1 than for SUR2A(Y1206S). The result show clear differences in the binding behavior between type A and type B- lignads and point at special characteristics of piperidino compounds within the group of B-ligands. The type B-ligands, repaglinide, metiglinide and AZ-DF265 show the same binding affinity to SUR1 and SUR2A(Y1206S). Coexpression with Kir6.2 show the same effect with the exception of AZ-DF265. AZ-DF265 show selectivity to pancreatic Kir6.2/SUR1 KATP channels. The results were published in Quast et. al, Diabetes 53: Suppl. 3, S156-S164, 2004 and demonstrate for the first time the impact of coexpression with Kir6.2 of the affinity to SUR for SUs and glinides and show that this effect dependent on SUR-subtype.