Immunmodulation durch Litomosoides sigmodontis (Nematoda, Filarioidea) und Echinococcus multilocularis (Cestoda) : Auswirkungen einer Helmintheninfektion auf eine LPS-induzierte Sepsis und Identifizierung einer anti-inflammatorischen Substanz

Abstract

Infektionen mit Helminthen führen oft zu chronischen Erkrankungen, die durch eine generalisierte Immunsuppression und ein unauffälliges Krankheitsbild gekennzeichnet sind. Helminthen modulieren dabei aktiv das Immunsystem ihrer Wirte, wodurch nicht nur entzündliche Abwehrreaktionen des Wirtes supprimiert, sondern gleichzeitig die Persistenz des Parasiten in den Wirten erleichtert wird. In vorliegender Arbeit wurde Litomosoides sigmodontis, eine Nagetierfilarie, sowie Echinococcus multilocularis, der Fuchsbandwurm, verwendet, um eine Lipopolysaccharid (LPS)-ausgelöste Entzündungsreaktion zu mildern. Hierfür wurden Mäuse mit verschiedenen Stadien von L. sigmodontis oder dem Metacestodenstadium von E. multilocularis infiziert und nach einiger Zeit eine Sepsis experimentell ausgelöst. Außerdem wurden die sekretorischen/exkretorischen Produkte von E. multilocularis auf ihre immunmodulatorischen Eigenschaften in vitro getestet, wodurch anti-inflammatorisch wirksame Komponenten identifiziert werden sollten. Dabei wurden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) von Blutspendern mit LPS stimuliert und daraufhin untersucht, ob durch die Metacestodenprodukte, die Produktion der TH1-Zytokine IL 12 und TNFa gehemmt wird. Bei den Experimenten mit L. sigmodontis wurden die Mäuse mit den einzelnen Parasitenstadien konfrontiert. Mit Mikrofilarien (Mf) infizierte Mäuse zeigten bei der Gabe einer subletalen Dosis von LPS einen letalen Verlauf, der durch eine drastische Erhöhung von TH1-Zytokinen und proinflammatorischen Chemokinen, einer Zunahme der Monozyten und Granulozyten im peripheren Blut und einer starken Temperaturabnahme gekennzeichnet war. Die Implantation von Filarienweibchen aus patenten Infektionen resultierte nach subletaler LPS-Gabe in einem letalen Infektionsverlauf, wie er auch schon bei den Mf-infizierten Mäusen beobachtet wurde. Dieser letale Verlauf resultierte vermutlich daraus, dass das Immunsystem nicht, wie bei natürlichen Infektionen, durch die adulten Filarienweibchen vor der Mf-freisetzung moduliert werden konnte. Bei Implantation von adulten L. sigmodontis-Weibchen aus postpatenten oder präpatenten Infektionen, bei denen keine Mf im peripheren Blut der Mäuse nachweisbar waren, veränderten sich hingegen die Konzentrationen der TH1-Zytokine nicht oder wurden bei Filarien aus präpatenten Infektionen sogar deutlich vermindert im Vergleich zu den LPS-behandelten scheininfizierten Kontrollen. Alle Tiere mit Filarien aus präpatenten oder postpatenten Infektionen überlebten die LPS-Injektion. Die Verwendung von MARCO-ko-, IFNgR-ko- und TNFR1-ko-Mäusen zeigte, dass die letalen Infektionsverläufe nach Mf-infektion und LPS-Gabe im Wesentlichen durch Makrophagen, IFNγ und TNFa, die die Inflammationskaskade einleiten, vermittelt wurden. Mf im peripheren Blut der Empfängertiere induzierten das TH1-typische Zytokin IFNg, unabhängig davon ob adulte Filarien in den Versuchstieren vorhanden waren. Das IFNg aktiviert Monozyten, NK-Zellen und neutrophile Granulozyten, die allein durch die Mf-infektion vermehrt im peripheren Blut vorhanden waren. Zudem kann die IFNg-Induktion die Expression des TLR4 (sowie MD-2 und MyD88) auf Monozyten hochregulieren, wodurch diese auf die nachfolgende LPS-Injektion verstärkt reagieren. Die einzelnen Stadien von L. sigmodontis können demnach eine LPS-induzierte Sepsis sowohl günstig als auch letal verlaufen lassen. Im zweiten Teil dieser Arbeit, konnte gezeigt werden, dass E. multilocularis-infizierte Mäuse im Sepsisversuch eine vermutlich durch IL-10-vermittelte Suppression der TH1-vermittelten Entzündungsreaktion hatten, die sich jedoch nicht eindeutig in der Überlebensrate widerspiegelte. Der Metacestodenkulturüberstand mit und ohne Vesikel hemmte in vitro die Ausschüttung der TH1-Zytokine IL-12 und TNFa von LPS-stimulierten PBMC. Genexpressionsanalysen zeigten dabei, dass der vesikelfreie Überstand Gene beeinflusst, die an der Apoptose, Zellbewegung, reifung, proliferation und –differenzierung beteiligt sind. Außerdem konnten mit BAT1 und CD47 zwei Gene identifiziert werden, die als negative Regulatoren der Entzündungsreaktion gelten. Durch die Fraktionierung des vesikelfreien Überstandes mittels HPLC konnte eine Fraktion ermittelt werden, die sowohl die IL-12- als auch die TNFa-Ausschüttung der LPS-stimulierten PBMC hemmte. Diese Fraktion enthielt zwei Peptide (1019 und 1915 Da), wovon eines als am Tyrosin modifiziertes Fibrinopeptid B (1915 Da) identifiziert wurde. Ein synthetisch hergestelltes Peptid mit gleicher Sequenz wie das Fibrinopeptid B, dem jedoch die Modifikation am Tyrosinrest fehlte, hemmte dosisabhängig die LPS-induzierte TNFa- und IL-12-Freisetzung. Diese Ergebnisse zeigen, dass sekretorische/exkretorische Produkte von Helminthen die Fähigkeit haben entzündliche Immunreaktionen zu hemmen. Dadurch verbessern Parasiten. nicht nur ihre Überlebenschancen in ihren Wirten sondern vermindern gleichzeitig die Krankheitssymptome bei einer Infektion.

Infections with helminths often cause a chronic disease, which is characterized by a generalized immune suppression and a non-apparent disease pattern. Helminths actively modulate the immune system of their hosts through secretory/excretory substances, not only suppressing the inflammatory response of their hosts but also faciliating persistence in their hosts. In recent years the researche about the potential of helminths to modulate the immune system of their hosts have increased and the course of disease from autoimmune diseases in humans as well as allergy models could be favorably influenced by helminths or their secretory/excretory products. In this present animal-experimental work we used the nematode Litomosoides sigmodontis, a rodent filarial, as well as the cestode Echinococcus multilocularis, the small fox tapeworm, to allay the lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory response. Therefore, mice were infected with different stages of L. sigmodontis or the metacestode-stage of E. multilocularis and after a while sepsis was experimentally provoked. Furthermore, secretory/excretory products of the metacestode were investigated in vitro on their immune modulatory capacity, whereby anti-inflammatory components should be identified. Thus, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were stimulated with LPS and it was examined to see if metacestode products suppress the TH1-cytokines IL-12 und TNFa. In the experiments with L. sigmodontis, mice were challenged in different ways with the specific parasite stages. Mice infected with microfilariae showed, after the injection of a sub-lethal dose of LPS, a lethal course of disease. It was characterized by a dramatic rise of TH1-cytokines and proinflammatory chemokines, an augmentation of monocytes and granulocytes in the peripheral blood and an intense decrease of body temperature. The implantation of female filarial from patent infections resulted after sub-lethal LPS-challenge in a similar lethal course of disease as in microfilariae-injected mice. This lethal course of sepsis most likely resulted from the missing modulation of the immune system by adult female filarial before the release of microfilaria, which is given in natural infections. Implantation of adult female L. sigmodontis from postpatent or prepatent infections, where there was no detectable microfilariae in the peripheral blood of mice, the concentration of TH1-cytokines did not change or was even diminished in mice harboring filarial from prepatent infections compared to LPS-challenged sham-treated controls. All animals harboring filarials from prepatent or postpatent infections survived the LPS injection.

The use of MARCO-ko-, IFNgR-ko- and TNFR1-ko-mice showed that the lethal course of microfilaria-infection and LPS-injection was mediated by macrophages, IFNg and TNFa, which induce the inflammatory cascade. Microfilaria induced the TH1-typical cytokine IFNg in the peripheral blood of the donor animals, independent of adult filarial in the laboratory animals. IFNg activates monocytes, natural killer cells and neutrophile granulocytes, which were increased by microfilaria injection alone in the peripheral blood. Furthermore, IFNg-induction is able to up regulate the expression of TLR4 (as well as MD-2 and MyD88) on monocytes, whereby those react stronger to the following LPS-injection. Specific stages of L. sigmodontis could therefore cause a beneficial as well as lethal course of LPS-induced sepsis. In the second part of this research it was shown that E. multilocularis-infected mice had a probably IL-10-mediated suppression of TH1-arranged inflammatory reaction in the sepsis experiment. But this did not clearly affect the survival rate compared to sham treated controls. The metacestode culture supernatant with or without vesicles inhibited the release of the TH1-cytokines IL-12 and TNFa from LPS-stimulated PBMC in vitro. Gene expression analysis showed that vesicle free supernatant influenced genes which are involved in apoptosis, motility, maturation, proliferation and differentiation of cells. Furthermore, two genes, BAT1 and CD47, were identified, which are known as negative regulators of inflammation. Fractionation of vesicle free supernatant by means of HPLC revealed a fraction that reduced IL 12- as well as TNFa-release from LPS-stimulated PBMC. This fraction contained two peptides (1019 and 1915 Da), whereof one is identified as fibrinopeptide B (1915 Da) with a modification at the tyrosine. A synthetically produced fibrinopeptide B, which missed the modification at the tyrosinrest, could dose dependently inhibit the LPS-induced TNFa- and IL 12-release. These results show that secretory/excretory products from helminthes have the capacity to reduce inflammatory immune reactions. Thus parasites not only ameliorate their chance to survive in their hosts, but also they simultaneously reduce the symptoms of disease.