Innate Resistenz gegen Litomosoides sigmodontis (Nematoda, Filarioidea) in der Labormaus : Untersuchungen zur Genetik, Genomik, Parasitologie und Immunologie Mikrofilarämieresistenz-kongener Labormausstämme

Abstract

Filarien sind in Wirbeltieren parasitierende Nematoden mit in der Regel ausgeprägter Wirtsspezifität, die das Immunsystem ihrer Wirte modulieren und dadurch der Immunabwehr entgehen. Dies gelingt jedoch nur in geeigneten, suszeptiblen Wirten. Genetische Unterschiede zwischen den Individuen einer möglichen Wirtspopulation scheinen dabei eine wichtige Rolle zu spielen. Untersuchungen an der Nagetierfilarie Litomosoides sigmodontis in der Labormaus erlauben die Fokussierung auf die genetischen Determinanten für Resistenz und Suszeptibilität. In DBA/1-Mäusen werden injizierte Mikrofilarien von L. sigmodontis innerhalb der ersten ein bis zwei Tage eliminiert, bei BALB/c-Mäusen zirkulieren sie teilweise länger als einen Monat im Blut. Mäusestämme, die innerhalb von vier Tagen Mikrofilarien vollständig eliminieren, werden hier als resistent, solche mit längerer Mikrofilarämie als suszeptibel definiert. Durch Kreuzung beider Stämme und anschließende serielle Rückkreuzung resistenter Nachkommen mit BALB/c wurde ein zu BALB/c kongener Mäusestamm etabliert (BALB/c.DBA/1-mfr), der einen resistenten Phänotyp zeigt. Aufgrund der Spaltungsverhältnisse bei diesen Kreuzungen kann ein monogener, autosomaler und dominanter Erbgang für diese Resistenz angenommen werden. Mittels genomweiter Mikrosatellitenanalyse konnte der Mikrofilarämie-Resistenzlocus (mfr) auf Chromosom 12 distal des Centromers in einer Region zwischen 56 und 61 cM lokalisiert werde. Daneben scheinen 2 weitere Loci auf den Chromosomen 3 und 9 modulierend auf die Ausprägung der Resistenz zu wirken, essenziell für eine definitionsgemäße Resistenz ist aber nur der mfr. Kandidaten für den mfr sind derzeit unter anderem Gene, die mit dem TNF-Signalweg assoziiert sind und solche, die allgemein auf die Ausbildung von TH1- und TH2-gesteuerten Immunant¬worten einwirken, die für die variablen Regionen der schweren Immunglobulinketten kodierenden Gensegmente sowie Akt1, das mit Apoptose bzw. Zell-Überleben assoziiert ist. Mit BALB/c.DBA/1-mfr und BALB/c wurden Genexpressionsanalysen durchgeführt. Bereits naive Tiere zeigten wenige, aber klar definierte Unterschiede in der Expression unter anderem von Genen der Kandidatenregion bzw. von Genen, die mit solchen assoziiert sind. Scheinbehandlungen durch Injektion von Zellkulturmedium führten zur Expression vieler proinflammatorischer und an der Regulation des Zellzyklus beteiligter Gene. Verschiedene immunologisch bedeutsame Gene, darunter einige der in der Kandidatenregion lokalisierten Immunglobulin-Gensegmente und Gene, die an der Regulation apoptotischer Prozesse beteiligt sind, waren zwischen mfr-kongenen Mäusen differenziell reguliert. Mikrofilarieninjektionen führten bei suszeptiblen BALB/c-Mäusen zur Regulation von 10-mal so vielen Genen wie bei resistenten Tieren, darunter verschiedener am Akt-Signalweg beteiligter Gene. Durch Implantation adulter Filarienweibchen, die den Abbau nachfolgend injizierter Mikrofilarien in resistenten Tieren deutlich verzögert, wurden rund 10-mal mehr Gene bei resistenten Mäusen differenziell exprimiert als bei BALB/c-Mäusen. Filarienweibchen scheinen durch Änderung der Genexpression resistenter Mäuse eine das Überleben der Mikrofilarien begünstigende Umgebung zu schaffen, während BALB/c eine solche bereits per se bieten. Eine direkte Beteiligung von Makrophagen und T-Zellen an der innaten Resistenz konnte nicht nachgewiesen werden, wohingegen Granulozyten und NK-Zellen darin involviert zu sein scheinen. Durch Kreuzungsexperimente mit B-Zell-defizienten Ig-alpha-Knockout- bzw. B- und T-Zell-defizienten SCID-Mäusen und BALB/c.DBA/1-mfr konnte eine essenzielle Funktion von B-Zellen für die innate Resistenz gezeigt werden. Wenn Antikörper hierbei eine Rolle spielen, müssten es unspezifische natürliche Antikörper sein, da bei resistenten Mäusen die Mikrofilariendichten bereits zwei Stunden nach Injektion signifikant unter denen suszeptibler Tiere lagen. Resistente Tiere wiesen bereits vor Infektion signifikant höhere Konzentrationen verschiedener unspezifischer Immunglobuline auf als BALB/c. Eine Übertragung humoraler Resistenzfaktoren via Blut, Serum oder Milch war jedoch nicht möglich. Anatomische oder unspezifische physiologische Unterschiede zwischen mfr-kongenen Tieren, etwa in der Lungenanatomie oder -physiologie, konnten als Ursache für die extrem verschiedenen Phänotypen ausgeschlossen werden. Natürliche Infektionen mit dritten Larven zeigten, dass der mfr nicht nur die Resistenz bei einer experimentellen Mikrofilarieninfektion vermittelt, sondern sich auch bei einer natürlichen Infektion auswirkt. Während in beiden kongenen Mäusestämmen eine Weiterentwicklung zu adulten Würmern erfolgte, blieben diese in den resistenten Mäusen signifikant kürzer als in den suszeptiblen.

Filarial nematodes are in most cases largely host specific parasites of vertebrates. In order to evade the immune defence these parasites modulate their hosts immune system. This is only possible in suitable susceptible hosts. Genetic differences between possible host individuals seem to play an important role. Experiments with the rodent filaria Litomosoides sigmodontis in the laboratory mouse allow focussing on the genetic determinants for resistance and susceptibility. DBA/1 mice eliminate injected microfilariae of L. sigmodontis within one or two days, whereas in BALB/c mice microfilariae circulate up to one month and longer in the peripheral blood. Mouse strains which are able to eliminate injected microfilariae until four days after injection were defined as resistant; strains exhibiting longer lasting microfilaraemia were defined as susceptible. A resistant mouse strain congenic to BALB/c was established (BALB/c.DBA/1-mfr) by crossing these two strains and consecutive serial backcrossing of resistant offspring with susceptible BALB/c mice. The segregation ratios of resistant and susceptible offspring in these crosses suggest a monogenic autosomal and dominant trait for the resistance. By genome wide microsatellite analysis a microfilaraemia resistance locus (mfr) was located on chromosome 12 distal of the centromere between 56 and 61 cM. On chromosomes 3 and 9, respectively, two more loci seem to modulate the resistance, but only mfr is essential for elimination of microfilariae before day 4 p. i. Candidate genes are several genes associated with TNF signalling, several genes involved in the regulation of TH1 and TH2 immune responses, the gene segments encoding immunoglobuline heavy chains and Akt1 which is associated with apoptosis and cell survival. Gene expression analyses were performed with BALB/c.DBA/1-mfr and BALB/c. Naïve animals showed few but clearly defined differences in the expression of several candidate genes or of associated genes. Sham infected animals showed the expression of many proinflammatory genes and genes involved in cell cycle regulation. Several immunologically important genes were differentially expressed between mfr congenic mice, among them again several genes of the candidate region. After injection of microfilariae about 10 times more genes were differentially expressed in BALB/c mice than in resistant mice. Some of these genes are involved in Akt signalling. Implantation of adult female filariae, which generally delays elimination of subsequentially injected microfilariae in resistant mice, led to the differential expression of more than 10 times as many genes in resistant mice than in BALB/c. Female filariae seem to create a positive environment for the microfilariae by altering the gene expression in resistant mice, whereas in BALB/c this seems not to be necessary. Direct involvement of macrophages and T cells in innate resistance could not be shown, but granulocytes and natural killer cells seem to be involved. An essential role for B cells in mediating innate resistance was shown by crossing B cell deficient Ig-alpha knockout mice and B and T cell deficient SCID mice respectively, with BALB/c.DBA/1-mfr. As resistant and susceptible mice exhibited significant differences in microfilaraemia already two hours p. i. only unspecific natural antibodies could be made responsible. In fact, resistant animals showed significantly higher concentrations of different unspecific immunoglobulines than BALB/c. However, a transfer of humoral resistance factors via blood, serum or milk was not found. The extremely different phenotypes are not based on anatomical or unspecific physiological differences between mfr congenic mice, e. g. in lung anatomy and physiology. Infection experiments with third stage larvae showed the importance of the mfr not only in experimental infections with microfilariae but also in natural infections. Whereas in both congenic mouse strains third stage larvae developed into adult worms, in BALB/c.DBA/1-mfr these adult worms were significantly shorter than in BALB/c mice.