Identifizierung und Charakterisierung neuer Aktivierungsmarker auf basophilen Granulozyten

Abstract

Basophile und Mastzellen sind wichtige Effektorzellen entzündlicher Reaktionen. Im Unterschied zu Eosinophilen und Neutrophilen verfügen sie über hochaffine Immunglobulin (Ig) E-Rezeptoren, die durch Bindung von Allergenen an rezeptorgebundenes IgE vernetzt und dadurch aktiviert werden. Dies führt zur Ausschüttung verschiedener Mediatoren in den Extrazellulärraum. Zusätzlich kommt es zur Verschiebung von in Granula gespeicherten Membranproteinen wie CD63 und dem Ektoenzym CD203c an die Plasmamembran. Diese Aktivierungsmarker werden inzwischen routinemäßig in durchflußzytometrischen Basophilenaktivierungstests angewendet. Die Größe der durch die beiden Marker CD63 und CD203c erkannten Populationen unterscheidet sich deutlich. So zeigt nur eine Subpopulation der Zellen die auf Allergenstimulation CD203c hochregulieren auch eine gesteigerte Oberflächenexpression von CD63. Außerdem unterscheidet sich das kinetische Profil der Hochregulierung von CD63 sowie die Sensitivität gegenüber Inhibitoren und Aktivatoren der durch FcRI vermittelten Signaltransduktion gegenüber CD203c. Kürzlich wurde gezeigt, dass Tetradecanoylphorbolacetat (TPA), ein Aktivator der Proteinkinase C (PKC), zu einer beschleunigten und verstärkten Hochregulierung von CD203c, jedoch zu einer verzögerten Hochregulierung von CD63 führt. Im Gegensatz dazu unterdrückt der Inhibitor der Phosphoinositol-3-Kinase (PI3K) Wortmannin sowohl die Hochregulierung von CD203c als auch von CD63. Mittels doppelter Fluoreszenzmarkierung wurden >200 monoklonale Antikörper, die im Rahmen des 8. Internationalen Workshops humaner Leukozytendifferenzierungsantigene (HLDA8) zur Verfügung standen, auf ihre Reaktivität mit ruhenden und aktivierten CD203c+ Basophilen getestet. Vier Antikörper die nicht bzw. nur schwach mit ruhenden Basophilen reagierten zeigten eine erhöhte Reaktivität mit Basophilen die durch Vernetzung des hochaffinen IgE-Rezeptors (FcRI) mit einem IgE-Antikörper aktiviert wurden. Dabei handelte es sich um zwei Antikörper gegen CD164 (WS-80160, Klon N6B6 und WS-80162, Klon 67D2) sowie zwei Antikörper mit zunächst unbekannten Spezifitäten, die durch Immunpräzipitation und anschließende Massenspektrometrie als CD13 (WS-80274, Klon A8) und CD107a (WS80280, Klon E63-880) identifiziert werden konnten. Die Aktivierungsmuster folgten entweder dem Profil von CD203c oder dem von CD63. Das CD203c-Profil ist durch eine rasche Hochregulierung gekennzeichnet, mit einem Maximum 5- 15 Minuten nach der Stimulation. Hierzu gehören die Marker CD13, CD164 und CD203c. Der PI3K-Inhibitor Wortmannin unterdrückt die Hochregulierung dieser Marker, während TPA eine schnelle und FcRI-unabhängige Hochregulierung mit einem Maximum nach 1- 2 Minuten induzierte. Die Marker des CD63-Profils erreichen die maximale Hochregulierung erst nach 20- 40 Minuten, nach Stimulation mit TPA erst nach 60 Minuten. Hierzu gehören CD63 und CD107a. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit CD13, CD164 und CD107a als neue Aktivierungsmarker auf basophilen Granulozyten identifiziert werden. Die unterschiedlichen kinetischen Profile sowie die unterschiedliche Sensitivität gegenüber Inhibitoren und Aktivatoren der Signaltransduktion legen nahe, dass die Marker der „CD203c-Gruppe“ und der „CD63-Gruppe“ jeweils mit unterschiedlichen Mechanismen der Basophilenaktivierung verknüpft sind.

Basophils and mast cells are important effector cells of inflammatory reactions. In contrast to eosinophils and neutrophils, they possess high-affinity immunoglobulin (Ig) E receptors (FcRI) that are cross-linked and thereby activated upon engagement of receptor-bound IgE with allergens, resulting in the release of several mediators to the extracellular space. In addition, membrane bound activation markers like the granuleassociated molecule CD63 and the ecto-enzyme CD203c are relocated to the plasma membrane. These markers are now routinely used for flow cytometry-based basophil activation tests. However, the population size of activated basophils as defined by the CD63 and CD203c tests differs significantly. Thus, only a subpopulation of basophils that is sensitive to allergen-induced CD203c upregulation shows also an upregulated expression of CD63. Moreover, the kinetic profile of CD63 upregulation and the sensitivity to inhibitors and activators of FcRI-mediated signalling differs from that of CD203c. In a recent report it was demonstrated that tetradecanoyl phorbol acetate (TPA), a stimulator of the protein kinase C (PKC) pathway, leads to an accelerated and enhanced CD203c upregulation, but a delayed CD63 upregulation. In contrast, the phosphoinositol- 3 kinase (PI3K) inhibitor wortmannin effectively inhibited CD203c as well as the CD63 upregulation Using two-colour flow cytometry >200 antibodies submitted to the 8th International Workshop of Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA8) have been analyzed for their reactivity with resting and activated CD203c+ basophils. Four antibodies either non-reactive or weakly reactive with resting basophils exhibited an increased reactivity with basophils activated by anti-IgE-mediated cross-linking of the high affinity IgE receptor (FcRI). These include antibodies against CD164 (WS-80160, clone N6B6 and WS-80162, clone 67D2), as well as two reagents with previously unknown specificities that were identified as CD13 (WS-80274, clone A8) and CD107a (WS-80280, clone E63-880) using immunoprecipitation and subsequent mass spectrometry. The activation patterns followed either the “CD203c-like” or “CD63-like” activation profile. The CD203c profile is characterized by a rapid upregulation (of CD13, CD164, and CD203c), reaching maximum levels after 5- 15 min of stimulation. The PI3K-specific inhibitor wortmannin inhibited the upregulation of these markers whereas TPA induced a rapid and FcRI-independent upregulation within 1-2 min. In the CD63 profile, maximum upregulation (of CD63 and CD107a) was detected only after 20-40 min, and upregulation by TPA reached maximum levels after 60 min. In summary, CD13, CD107a, and CD164 were identified as novel basophil-activation antigens. Based on time kinetics of upregulation and sensitivity to signalling inhibitors and activators, it can be hypothesized that molecules of the “CD203c group” and the “CD63 group” are linked to two different mechanisms of basophil activation.