Aufbau und Evaluation eines diagnostischen PCR-Verfahrens zum Nachweis von spezifischer Paracoccidioides brasiliensis-DNA

Abstract

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war der Aufbau einer PCR-Methode zum Nachweis von DNA des dimorphen humanpathogenen Pilzes Paracoccidioides brasiliensis. Es wurde zuerst erwogen die Zielsequenz in die kleine Untereinheit der ribosomalen DNA (18S rDNA) zu legen, da die Anwesenheit multipler Kopien pro Genom eine hohe Sensitivität der Methode gewährleistet. Die erstmalig durchgeführte Sequenzierung des Gens zeigte jedoch eine ausgesprochene Homologie zu nahe verwandten Pilzarten. Da eine diagnostische PCR eine Unterscheidung der DNA insbesondere zu anderen dimorphen Pilzen leisten sollte, wurde als Alternative das Gen des P. brasiliensis spezifischen Glykoproteins gp43 gewählt. Die nested-PCR amplifizierte DNA ausschließlich von P. brasiliensis Isolaten, so dass sie zur Stammidentifizierung verwendet werden konnte. Aus 21 von 23 Lungenhomogenaten infizierter Mäuse konnte P. brasiliensis spezifische DNA amplifiziert werden, jedoch weder aus Lungenhomogenaten von 20 mit H. capsulatum intravenös infizierten Mäusen noch aus denen von zwei Kontrolltieren. Die Nachweisgrenze von 0,5 fg wurde mit klonierter Plasmid-DNA ermittelt. Diese konnte im Tiermodell mit Nachweis spezifischer DNA aus Lungenhomogenaten mit mindestens 1 x 103 bis maximal 1,3 x 107 Kolonie-bildenden Einheiten pro Gramm Gewebe bestätigt werden. Die Sequenzierung aller nested-PCR Produkte aus Lungenhomogenaten und von sieben Isolaten ergab in allen Fällen eine 100%ige Übereinstimmung mit dem gp43-Gen von P. brasiliensis in der Datenbank GenBank. Die erstmalig ermittelte Nukleotidsequenz der 18S rDNA von fünf P. brasiliensis Isolaten wurde mit den bekannten 18S rDNA-Sequenzen verwandter Pilze der Familien Gymnoascaceae, Arthrodermaceae und Onygenaceae in der Ordnung Onygenales verglichen. Unter Verwendung von drei dafür üblicherweise eingesetzten Methoden (Neighbor Joining, Maximum Parsimony und Maximum Likelihood) sowie unter Anwendung des Kishino-Hasegawa Tests wurde gezeigt, dass P. brasiliensis näher mit B. dermatitidis und E. parva verwandt ist als B. dermatitidis mit H. capsulatum, deren beide teleomorphen Formen zur Gattung Ajellomyces zählen. Übereinstimmend mit den Ergebnissen anderer Autoren wurde eine eindeutige Zuordnung von P. brasiliensis zur Familie der Onygenaceae festgestellt. Es finden sich Hinweise in der phylogenetischen Analyse, dass die Gruppe der Gattungen mit humanpathogenen Spezies, also Paracoccidioides, Emmonsia, Blastomyces und Histoplasma einen getrennten evolutionären Hintergrund haben. Dennoch sind die anderen Gattungen Auxarthron, Coccidioides, Malbranchea, Onygena, Renispora und Uncinocarpus, der Familie Onygenaceae nahe verwandt mit der ersten Gruppe. Nachdem P. brasiliensis auch anhand seiner 18S rDNA Sequenz taxonomisch in der Familie der Onygenaceae eingeordnet werden konnte, wurde eine spezifische und sensitive nested-PCR mit Zielsequenz im Gen des immundominanten gp43 Glykoproteins aufgebaut. Diese soll in der Diagnostik der Parakokzidiodomykose und zur Differenzialdiagnostik anderer endemischer Systemmykosen des Menschen in weiteren Studien evaluiert werden.

The goal of this study was to develop a specific and diagnostic PCR assay for detection of the dimorphic human pathogenic fungus P. brasiliensis. A common target used for diagnostic fungal PCR assays has been the 18S rRNA gene (rDNA) because its high frequency in the genome guarantees a high sensitivity. To determine the specificity of the 18s rDNA gene, we, for the first time, performed phylogenetic homology analysis by sequencing the 18S rDNA gene from five isolates of P. brasiliensis, and closely related fungi. Sequence alignment of the entire 18S rDNA of P. brasiliensis and closely related fungi including Blastomyces dermatitidis and Histoplasma capsulatum revealed high homology. Thus indicating that P. brasiliensis, B. dermatitidis, and Emmonsia parva were more closely related than H. capsulatum and B. dermatitidis, whose teleomorphic forms belong to one genus, Ajellomyces. In accordance with the work of other investigators, our data showed that P. brasiliensis must be grouped within the order Onygenales and is closely related to members of the family Onygenaceae. In addition, detailed molecular phylogenetic analysis suggested that the family Onygenaceae might be further divided into two families. The subgroup that includes P. brasiliensis comprises all zoopathogenic species. These groups can help to identify species of the members of the family Onygenaceae pathogenic for humans, but the findings also indicate that the reliance on gene probes within the 18S rDNA sequences has limited specificity. Therefore another target, the gp43 gene, which encodes an outer membrane protein that is highly immunogenic, unique and of diagnostic value in paracoccidioidomycosis, was evaluated by nested-PCR assay. The pg43 gene was amplified by nested PCR from lung homogenates of 21 out of 23 infected mice with concentrations ranging from 1 × 103 to 1.3 × 107 CFU of P. brasiliensis per g of lung. Uninfected and lung samples from 20 H. capsulatum-infected mice, as well as DNA from closely related fungi, gave negative results. A detection limit of 0.5 fg of specific DNA was determined using a standard curve developed from cloned plasmid DNA. Sequencing of all nested PCR products from lung homogenates and from seven P. brasiliensis isolates demonstrated 100% identity to the gp43 sequences of P. brasiliensis present in GenBank. In summary, we have developed a highly sensitive and specific nested PCR assay for the detection of P. brasiliensis in tissue samples using a sequence of the immunogenic gp43 gene. This assay may be useful for diagnosis of paracoccidioidomycosis in human tissue samples.