Die Mutation Y1206S steigert die Affinität des Sulfonylharnstoffrezeptors SUR2A für Glibenclamid und unterstützt den Einfluß der Koexpression mit KIR6.2

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-24777
http://hdl.handle.net/10900/44895
Dokumentart: PhDThesis
Date: 2006
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Sonstige
Advisor: Quast, Ullrich
Day of Oral Examination: 2004-05-19
DDC Classifikation: 610 - Medicine and health
Keywords: Sulfonylharnstoffrezeptor , Plasmamembran , Ionenkanal , Kaliumkanal
Other Keywords: Sulfonylharnstoffrezeptor SUR2A , Mutation SUR2A (Y1206S) , Glibenclamid , Öffner P1075 , KIR6.2 , Einfluß der Koexpreesion mit KIR6.2
sulfonylurea receptor SUR2A , mutation SUR2A(Y1206S) , glibenclamide , opener P1075 , KIR6.2 , effect of coexpression with KIR6.2
License: http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=de http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=en
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Inhaltszusammenfassung:

ATP-empfindliche Kaliumkanäle (KATP-Kanäle) kommen in allen erregbaren Zellen vor und sind vor allem bekannt als Ansatzpunkt der Sulfonylharnstoffe und Glinide, die durch Hemmung der Aktivität des Kanals in der ß-Zelle der Pankreas die Insulinsekretion fördern. KATP-Kanäle setzen sich aus vier schwach einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanaluntereinheiten der Familie KIR6.x und vier Sulfonylharnstoffrezeptoren (SUR) zusammen. SUR übernimmt die Steuerung der Kanalaktivität und enthält die Bindungsstellen der Sulfonylharnstoffe und der KATP-Kanalöffner. Die KIR6.x-Familie besteht aus zwei Mitgliedern: KIR6.1 kommt in Gefäßmuskelzellen und KIR6.2 in allen anderen erregbaren Zellen vor. Die SUR-Subtypen umfassen unter anderem SUR1 (B-Zelle, Gehirn), SUR2A (Herz- und Skelettmuskel) und SUR2B (glatte Muskelzellen). Beide Isoformen zeigen im Vergleich zu SUR1 eine geringere Affinität gegenüber Glibenclamid (GBC), dem bekanntesten Sulfonylharnstoff. In SUR1 wurde der Aminosäurerest Serin 1237 als wichtig für die GBC-Affinität erkannt, bei SUR2 ist dieser Rest durch Tyrosin 1206 ersetzt. Die Punktmutation Y1206S in SUR2B, bei welcher Tyrosin im SUR2B der Ratte durch Serin aus SUR1 ersetzt wurde, erhöht die Affinität des Rezeptors für GBC um einen Faktor 5-10 (Hambrock et al., 2001). In dieser Arbeit wurde die Frage untersucht, ob die identische Mutation in SUR2A das Bindungsverhalten gegenüber GBC in ähnlicher Weise verändert, wie es bereits bei SUR2B beobachtet wurde. Zur Untersuchung des SUR2A Wildtyps und der Mutanten standen HEK-Zellinien zur Verfügung. Zur Untersuchung der Ligandbindungseigenschaften von SUR2A und der Mutanten wurden Radioligandbindungsstudien mit tritiummarkiertem GBC und P1075 (einem KATP-Kanalöffner) durchgeführt. Insbesondere wurde der Einfluß der Mutation auf die Affinitäten zu GBC und P1075, auf die negativ allosterische Wechselwirkung zwischen MgATP und GBC und auf den Effekt der Koexpression mit KIR6.2 untersucht. Die Untersuchungen zeigten, dass die Mutation Y1206S in SUR2A die Affinität für GBC in HEK293B-Zellmembranen und in intakten Zellen um den Faktor 5 erhöht (von KD = 20 nM bei SUR2A auf 4.3 nM bei SUR2A(Y1206S)). Die Verringerung der Bindung in Anwesenheit von MgATP beruht im Wesentlichen auf einer Abnahme der Anzahl der verfügbaren Bindungsstellen. Die Affinität der Mutanten zu P1075 war gegenüber der des Wildtyps unverändert. Die Koexpression mit KIR6.2 erhöhte die Affinität der Mutanten für GBC signifikant mehr, als die des Wildtyps und dieser Effekt wurde durch MgATP verstärkt; hingegen wurde die Affinität für den Öffner P1075 leicht erniedrigt. Die negativ allosterische Wechselwirkung zwischen GBC und P1075 konnte durch die hohe Affinität der Mutanten für GBC in [3H]GBC-P1075-Verdrängungsexperimenten genau ausgemessen werden. Es zeigte sich eine biphasische Verdrängungskurve, deren Hochaffinitätskomponente die Affinität des Öffners zu SUR2A(Y1206S) wiedergibt. [3H]P1075-GBC-Verdrängungskurven waren hingegen monophasisch und unterschätzten die Affinität von GBC zur Mutanten deutlich. Diese Ergebnisse stimmen fast quantitativ mit den Beobachtungen überein die bei SUR2B(Y1206S) gemacht wurden. Dies zeigt, dass der Carboxyterminus von SUR2 eine relativ geringe Rolle bei der Bindung von Glibenclamid und P1075 sowie deren Modulation durch MgATP spielt und dass die Mutation Y1206S nicht auf den Carboxyterminus ausstrahlt.

Abstract:

ATP-sensitive K+ channels (KATP channels) serve important functions in many tissues (Ashcroft & Ashcroft, 1990; Seino & Miki, 2003) and are major drug targets for sulfonylureas and glinides. These substances block these channels in the pancreatic ß-cells and are promoting insulin scretion. KATP channels are complexes of four inwardly rectifying K+ channels (KIR6.x) and of four sulfonylurea receptors (SURs). SUR takes over the regulating of the channel activity and carries the binding sites for sulfonylureas and the openers (Aguilar-Bryan et al., 1995; Hambrock et al., 1998; Schwanstecher et al., 1998). There are two members of the KIR6.x family: KIR6.1 is found in smooth muscle cells and KIR6.2 is found in all excitable tissues. The SUR subunits contain SUR1 (ß-cell, brain), SUR2A (cardiac) and SUR2B (smooth muscle). The isoforms SUR2A and SUR2B only differs in the last 42 amino acids of the carboxy terminus. Both of them have a lower affinity for sulfonylureas, such as glibenclamide, than SUR1. The difference is mainly caused by serine 1237 in SUR1, a residue important for GBC binding, corresponding to tyrosine 1206 in SUR2A and SUR2B. The mutation Y1206S in SUR2B increased the affinity of SUR2B for GBC by 5- to 10-fold (Hambrock et al.; 2001). One of the aims of this study was to examine the ligand binding properties of SUR2A(Y1206S) mutant for GBC and openers and there interrelationship. Furthermore, we examined wether the mutation Y1206S in SUR2A had effects similar to those in SUR2B. To examine the ligand binding properties of SUR2A und the mutant use was made of radioligand binding experiments with [3H]-GBC and [3H]-P1075. The experiments showed that the mutation Y1206S increased the affinity of SUR2A for GBC in the membranes of the HEK293B cell-line and in intact cells ~ 5 times (SUR2A: KD = 20nM; SUR2A(Y1206S): KD = 4.3nM) (Stephan et al., 2005). The decrease of the KD for GBC in the presence of MgATP founded on the reduction of the number of GBC binding sites. Comparison with the corresponding value for SUR2A wild-type showed that the mutation left affinity of SUR2A for P1075 essentially unchanged. Coexpression with KIR6.2 increased the affinity ot the mutant for GBC significantly more than the affinity of the wild-type. Furthermore, the effect was enhanced by MgATP. On the other side, coexpression with KIR6.2 decreased affinity for the opener P1075 slightly. Because of the high affinity of the mutant for GBC the negative allosteric interactions between GBC and P1075 could determined exactly in [3H]-GBC -P1075 experiments. P1075 inhibited [3H]-GBC binding to SUR2A(Y1206S) in a markedly biphasic manner. The high-affinity component gives the true affinity of SUR2A(Y1206S) for the opener. The negative allosteric interaction between GBC and P1075 was also probed using [3H]-P1075. GBC inhibited [3H]-P1075 binding in a monophasic manner and underestimates the true affinity of GBC for the mutant. The data show that the changes were similar to those observed with SUR2B(Y1206S) and that the differences in the last 42 carboxy-terminal amino acids of SUR2A and SUR2B are of limited influence on the binding of GBC and P1075 and on the modulation with MgATP.

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