Spender- und kulturabhängige Expression knorpelrelevanter Markergene humaner artikulärer Chondrozyten

Abstract

Das eingeschränkte Heilungsvermögen des hyalinen Gelenkknorpels stellt im klinischen Alltag ein großes Problem dar. Die Therapie von Knorpeldefekten bedarf eines umfassenden Verständnisses der Biologie des Gelenkknorpels. Es wurde die Expression mito- und morphogener Wachstumsfaktoren unter verschiedenen Zellkulturbedingungen analysiert. Die qualitative Genexpression von TGF beta-1, -2, -3, BMP-2, GDF-5, CTGF wurde mittels mRNA-Messung untersucht. Verglichen wurden artikuläre humane Knorpelzellen, expandiert in einem zweidimensionalen, dedifferenzierungsfördernden Kultursystem (Monolayer), mit Zellen desselben Spenders, rekultiviert in einem dreidimensionalen, differenzierungsfördernden Kultursystem (Alginat). Es wurde untersucht, ob unter den beschriebenen Bedingungen nicht nur kultur- sondern auch spenderabhängige Unterschiede in der Expression der genannten Markergene auftreten. Qualitative Expressionsanalysen wurden mittels Endpunkt RT/PCR durchgeführt. Quantitative Expressionsanalysen zur eingehenderen Untersuchung ausgewählter Wachstumsfaktoren (GDF-5 und BMP-2) wurden mit 'real time'- PCR durchgefuhrt. Die Dedifferenzierung der Chondrozyten in Monolayerkultur konnte anhand histologischer, immunhistologischer und expressionsanalytischer Methoden bestätigt werden. Ebenso konnte phänotypisch und expressionsanalytisch die Erhaltung des differenzierten Chondrozyten in der dreidimensionalen Kultur in Alginat nachgewiesen werden. Die quantitative Expressionsanalyse frisch isolierter Chondrozyten zeigte signifikante patientenabhängige Unterschiede der Expression des Matrixproteins Kollagen-Typ-II. Dies kann einen wichtigen Hinweis auf die Qualität des verwendeten Biopsiematerials geben. Die Zellqualität konnte einen erheblichen Einfluss auf die therapeutischen Erfolgsaussichten bei der autologen Chondrozytentransplantation haben. Bei den untersuchten Wachstums- und Differenzierungsfaktoren erbrachten die qualitativen Expressionsanalysen keine mRNA Differenzen. Die quantitativen Expressionsanalysen von BMP-2 und GDF-5 zeigten jedoch signifikante Unterschiede. Somit konnte BMP-2 als Differenzierungsmarker und GDF-5 als Dedifferenzierungsmarker verwendet werden. Insbesondere für die autologe Chondrozytentransplantation scheint eine Qualitätsanalyse des vorhandenen Zellmaterials von Bedeutung, da dies prognostischen Charakter für den therapeutischen Erfolg haben könnte. Eine derartige Qualitatsanalyse könnte nach den hier vorliegenden Ergebnissen neben der phänotypischen Analyse auch die quantitative Expressionsanalyse von Kollagen-Typ-II, BMP-2 und GDF-5 beinhalten.

The restricted healing capacity of hyaline cartilage represents a major clinical challenge. Effective treatment of cartilage defects necessitates a thorough understanding of articular cartilage biology. The expression of mito- and morphogenic growth factors was analyzed under several different cell culture conditions. The qualitative gene expression of TGF beta-1, -2, -3, BMP-2, GDF-5, and CTGF was investigated using mRNA analysis. Human articular chondrocytes were expanded in a two dimensional culture system conducive to dedifferentiation (monolayer). These cells were compared to chondrocytes of the identical donor re-cultivated in a three dimensional culture system conducive to differentiation (alginate). It was investigated whether not only cell culture specific but also donor dependent differences result in differential expression of investigated marker genes. Qualitative expression analyses were performed using endpoint RT/PCR. Quantitative expression analyses for further investigation of selected growth factors (GDF-5 and BMP-2) were performed using real time PCR. Dedifferentiation of chondrocytes grown in monolayer was confirmed by histologic, immune histologic and gene expression analysis. Furthermore, the continued differentiated state of chondrocytes in alginate culture was demonstrated. The quantitative expression analysis of freshly isolated chondrocytes revealed significant donor dependent differences of the cartilage matrix protein collagen-type-II. This may provide an important indicator for the level of quality exhibited by the used biopsy material. The level of quality may represent an important factor contributing to the therapeutic success of autologous chondrocyte transplantation. The investigated growth and differentiation factors demonstrated no significant differences of qualitative mRNA expression. Quantitative expression analysis of BMP-2 and GDF-5 resulted in significant differences, though. Therefore, BMP-2 could be used as marker for differentiation and GDF-5 as marker for dedifferentiation. Analysis of harvested cell quality may be of importance for autologous chondrocyte transplantation in particular, since this may constitue a prognostic indicator for therapeutic success. Based on the presented results, this specific type of quality analysis may encompass phenotype analysis and include expression analysis of collagen-type-II, BMP-2 and GDF-5.