Phänotypische und genotypische Charakterisierung der Virostatika-Suszeptibilität von Herpes Simplex Virusisolaten nach Stammzelltransplantation

Abstract

Ziel dieser Dissertation war die Etablierung eines zeit- und arbeitsoptimierten, quantitativen, phänotypischen Testsystems zur Erfassung der Aciclovir-Resistenz von klinischen Herpes Simplex Virusisolaten. Den Hintergrund bildet die hohe Inzidenz der Aciclovir-Resistenz bei Patienten nach Stammzelltransplantation, welche in Studien bis zu 30% erreichte. Die Resistenzmechanismen, welche auf molekularbiologischer Ebene der verminderten Suszeptibilität gegenüber Aciclovir zugrunde liegen, sind Mutationen innerhalb des Genabschnittes UL 23, welcher bei Herpes Simplex Viren für die Thymidinkinase kodiert. In seltenen Fällen erfolgen Mutationen innerhalb des für die virale Polymerase kodierenden Genabschnittes UL 30. Für die Etablierung von schnelleren, genotypischen Testungen ist eine genaue Kenntnis des umfangreichen natürlichen Polymorphismus und aller mit Resistenz assoziierten Mutationen innerhalb der Gene UL 23 und UL 30 von HSV 1 und HSV 2 notwendig. Da dies noch nicht ausreichend erfolgt ist, erlaubt nur die Sequenzierung von sequentiellen Patientenisolaten, in Kombination mit der phänotypischen Charakterisierung, die sichere Identifizierung einer Aciclovir-Resistenz. Für die phänotypische Erfassung der Aciclovir-Resistenz wurden ein CPE (Zytopathischer Effekt)-Reduktionstest, ein Plaquereduktionstest und ein Screening-Plaquereduktionstest, sowie ein auf Chemolumineszenzanalytik basierender Zytopathogenitätstest etabliert und evaluiert. Der Plaquereduktionstest gilt weltweit als Goldstandard, ist jedoch zeit- und arbeitsintensiv. Von 15 Stammzelltransplantatempfängern wurden 41 sequentielle Isolate phänotypisch charakterisiert und typisiert. 16 Isolate wurden als Aciclovir-resistent identifiziert. Es handelte sich ausschließlich um Herpes Simplex Virus Typ 1. Von 11 Isolaten wurde das für die Thymidinkinase kodierende Gen UL 23 sequenziert. Darunter befanden sich 3 eigens im Rahmen dieser Arbeit generierte Aciclovir-resistente Laborstämme. Eine bisher noch nicht beschriebene Punktmutation in Zusammenhang mit Aciclovir-Resistenz (G200D) und eine neue Mutation im Rahmen des natürlichen Polymorphismus von UL 23 (A118V) konnten dabei nachgewiesen werden. Aussagen über den natürlichen Polymorphismus konnten nur getroffen werden, da kryokonservierte sequentielle Isolate für die Sequenzanalyse verfügbar waren. Bei Auftreten einer Aciclovir-Resistenz ist eine weitere Behandlung mit Foscarnet oder Cidofovir möglich. Wenn es sich um Herpes Simplex Virus Typ 1 handelt, ist unter Umständen auch eine weitere Therapie mit Brivudin erfolgreich. Da die gegenwärtigen Behandlungsregime begrenzt sind, besteht Bedarf an neuen antiviral wirksamen Medikamenten. Mit dem auf Chemolumineszenzanalytik basierenden Zytopathogenitätstest konnte die antivirale Wirkung einer an der Universität Tübingen neu synthetisierten Duplexverbindung, einem Nucleosid-Phosphono-Ameisensäurederivat, bei Aciclovir-resistenten Herpes Simplex Viren nachgewiesen und der zugehörige Selektivitätsindex (SI=CC50/IC50) bestimmt werden.

The purpose of this study was to develop a less cumbersome quantitative, phenotypic assay for the fast detection of aciclovir-resistant clinical herpes simplex virus isolates. The background for this research is the high incidence of aciclovir resistance by stem cell transplantation recipients. Indeed, different surveys have shown an incidence of resistance of up to 30%. The molecular changes which cause a decreased susceptibility against aciclovir are located in gene UL 23. In the case of the herpes simplex virus, this part is encoded for the thymidine kinase. In rare instances, mutations in gene UL 30, which encodes for viral polymerase, comprise a reasonable result emerging from this resistance. Faster genotypic tests require a vast knowledge of natural polymorphism and every mutation associated with resistance in the genes UL 23 and UL 30 of HSV 1 and HSV 2. Until now, only sequencing of sequential patient isolates combined with phenotypic characterization permits a certain detection of aciclovir resistance. Phenotypic characterization was done by a cytopathic effect reduction assay, plaque reduction assay, a faster screening plaque reduction assay, and also by a fluorescein-based cytopathogenicity assay. The plaque reduction assay is widely recognized as standard, but is cumbersome to perform. Phenotypic characterization as well as the typing of 41 sequential isolates derived from 15 stem cell transplantation recipients were completed. 16 Isolates were identified as aciclovir-resistant. Typing revealed only herpes simplex virus type 1. Gene UL 23 coding for thymidine kinase was sequenced from 11 Isolates. Among these isolates, 3 were specifically generated aciclovir-resistant laboratory strains. A previously undocumented point mutation in connection with the aciclovir resistance (G200D) and a new polymorphism in UL 23 (A118V) were detected. Results concerning natural polymorphism were possible, since cryo-conserved sequential isolates were available for sequencing. In cases of aciclovir resistance a further treatment with foscarnet or cidofovir is a possible. If the lesions are caused by herpes simplex virus type 1 a further treatment with brivudin can be successful in some cases. This temporary treatment is limited, though, and there is a real need for new antiviral therapy. With the fluorescein-based cytopathogenicity assay, the antiviral potency of a new amphiphilic duplex-drug developed at the University of Tübingen could be proven. This compound acts as a potent replication inhibitor of aciclovir-resistant herpes simplex viruses. In addition, the selectivity index (SI=CC50/IC50) that belongs to this compound could be determined.