Einfluss von Adenosin-2'-3'-Dialdehyd auf das Methylierungspotential und die Genexpression in HepG2-Zellen unter normoxischen Bedingungen

Abstract

In der dargelegten Arbeit wurde das Methylierungspotential (MP, Quotient aus SAM/SAH)) der HepG2-Zellen, einer humanen hepatozellulären Tumorzelllinie verändert und der Einfluss dessen auf die Expression ausgewählter Gene untersucht. Die Untersuchungen brachten folgende Ergebnisse: 1. HepG2-Zellen haben unter Kontrollbedingungen einen SAH-Spiegel von 0,04 ± 0,003 nmol/107Zellen und einen SAM-Spiegel von 1,8 ± 0,15 nmol/ 107Zellen. Daraus lässt sich ein MP von 57,6 ± 7,4 berechnen. 2. Adenosin-2',3'-Dialdehyd (Ado-2',3'-Dial), ein potenter SAH-Hydrolase-Hemmstoff vermindert das MP in den HepG2-Zellen konzentrationsabhängig von 57,6 (Kontrolle) auf 1,2 (30 µM Ado-2',3'-Dial). 3. Die inhibitorische Wirkung von 30 µM Ado-2',3'-Dial auf das MP ist zeitabhängig: Das MP sinkt bereits nach ½ h Inkubation von den ursprünglichen 57,6 ± 7,4 auf 2,5 ± 0,1 und erreicht nach einer Inkubationsdauer von 24 h einen Wert von 1,2 ± 0,02. 4. Die Energieladung der HepG2-Zellen wird durch ein verändertes MP nicht beeinflusst. 5. Ado-2',3'-Dial hat bis zu einer Konzentration von 30 µM keinen Einfluss auf die Vitalität der Zellen. 6. Mittels real time-PCR-Analysen wurde gezeigt, dass ein verändertes MP die Expression der ausgewählten Gene unterschiedlich beeinflusst. Während ein MP von 1,2 die Erythropoetin- (Epo) und VEGF-A-mRNA-Expression signifikant senkt, bleibt die Expression der SAH-Hydrolase und von Cyclophilin unverändert. 7. Auf Proteinebene konnte gezeigt werden, dass eine reduzierte Epo-mRNA-Expression mit einer verminderten Epo-Proteinsynthese einhergeht. 8. Die Aktivität der SAH-Hydrolase von HepG2-Zellen hat unter Kontrollbedingungen einen Wert von 4,0 ± 0,3 U. Bereits bei einer Ado-2',3'-Dial-Konzentration von 1 µM ist die Aktivität auf 0,16 U reduziert.

S-Adenosylhomocysteine (AdoHcy), a by-product and inhibitor of S-adenosylmethionine (AdoMet)-dependent methylation reactions is removed by AdoHcy hydrolase. The ratio of AdoMet and AdoHcy, also termed methylation potential (MP), is a metabolic indicator for cellular methylation status. In the present study, we have investigated the impact of changes in MP in HepG2 cells (achieved by AdoHcy hydrolase inhibition) on the expression of the following genes: Erythropoietin and vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) as examples for differentially regulated genes, cyclophilin as classical housekeeping gene, and AdoHcy hydrolase as part of the methylation pathway by using 18S rRNA as internal standard. Under control conditions the intracellular concentration of AdoMet and AdoHcy is 1.8 ± 0.15 nmol/107 cells and 0.04 ± 0.003 nmol/107 cells, respectively, resulting in a AdoMet/AdoHcy ratio of 57.6 ± 7.4. Inhibition of AdoHcy hydrolase by adenosine-2',3'-dialdehyde was found to decrease AdoMet/AdoHcy ratio in a time-dependent and concentration-dependent manner. The maximal inhibitory effect was observed when cells were incubated with 30 µM adenosine-2',3'-dialdehyde for 24 h. Under this condition the AdoMet/AdoHcy ratio decreased to 1.2 ± 0.02. In contrast, energy charge and cell viability were not influenced by inhibition of AdoHcy hydrolase. Real-time PCR analysis revealed that the mRNA levels of the studied genes respond differentially to changes in MP: Inhibition of AdoHcy hydrolase was associated with lowered erythropoietin and VEGF mRNA levels, whereas the mRNA expression of AdoHcy hydrolase and cyclophilin was insensitive to an altered MP. This implies that genes with a slower transcription rate and mRNAs with a slower turnover are insensitive to short-term changes in MP.