Freie-Fettsäure-induzierte Apoptose und Proteinkinase C-Expressionsmuster in Endothel- und glatten Muskelzellen humaner Koronararterien

Abstract

Fragestellung - Apoptose von vaskulären Endothel- und glatten Muskelzellen spielt bei der Pathogenese der Atherosklerose eine entscheidende Rolle. Da freie Fettsäuren in verschiedenen Zelltypen Apoptose induzieren, wurden die Effekte gesättigter und ungesättigter Fettsäuren auf die Apoptose von Endothel- und glatten Muskelzellen humaner Koronararterien untersucht. - Statine entfalten auch Cholesterin-unabhängige gefäßprotektive Wirkungen und können die Apoptose von Gefäßzellen sowohl erhöhen als auch erniedrigen. Deshalb wurde der Einfluss des Statins Atorvastatin auf die Lipoapoptose von Endothel- und glatten Muskelzellen humaner Koronar-arterien geprüft. - Um die mögliche Rolle der multifunktionalen Proteinkinase C (PKC) bei der Apoptose von Endothel- und glatten Muskelzellen humaner Koronararterien abzuklären, wurden das PKC-Expressionsmuster und die Effekte ver-schiedener Proteinkinase C-Inhibitoren untersucht.

Material und Methodik - Apoptoseraten wurden durch Analyse des Zellzyklus (subG1-DNA-Gehalt) bestimmt. - PKC-Expressionsmuster wurden mit Isoform-spezifischen Antikörpern und Western Blots sowie mit Light Cycler PCR analysiert. - Intrazelluläre PKC-Verteilung wurde mit konfokaler Lasermikroskopie und Isoform-spezifischen Antikörpern ermittelt.

Ergebnisse - In beiden Zelltypen induzierten die gesättigten Fettsäuren Palmitat (16:0) und Stearat (18:0) Apoptose, während die einfach ungesättigten Fettsäuren Palmitoleat (16:1) und Oleat (18:1) keinen Effekt zeigten. Die doppelt ungesättigte Fettsäure Linoleat (18:2) stimulierte die Apoptose in glatten Muskelzellen, nicht jedoch in Endothelzellen. - Palmitoleat, Oleat und Linoleat verringerten die Apoptose-fördernde Wirkung von Palmitat in Endothelzellen, erhöhten sie jedoch in glatten Muskelzellen. - Atorvastatin beeinflusste in keiner der beiden Zelltypen die spontane oder Fettsäure-induzierte Apoptose. - Das PKC-Expressionsmuster war in beiden Zelltypen identisch: PKC-alpha, -beta, -delta, -epsilon und -iota konnten nachgewiesen werden, während PKC-gamma, -eta, -theta und -zeta mit den verwendeten Methoden nicht nachweisbar waren. Langzeitinkubation mit TPA (20 Std., 500 nM) bewirkte eine "down regulation" der konventionellen und neuen PKC-Isoformen. - Die Effekte von PKC-Inhibitoren deuten darauf hin, dass PKC-iota bei der Lipoapoptose von Endothelzellen beteiligt ist. Die Rolle dieses Isoenzyms bei der Apoptose von glatten Muskelzellen konnte nicht eindeutig geklärt werden. Schlussfolgerungen - Lipoapoptose in Endothel- und glatten Muskelzellen humaner Koronararterien ist stark von der Kettenlänge der Fettsäuren abhängig. - Die Hemmung der Stearat-induzierten Apoptose durch die einfach ungesättigten Fettsäuren Palmitoleat und Oleat könnte zumindest teilweise erklären, weshalb dietäre ungesättigte Fettsäuren eine gefäßschützende Wirkung zeigen. - Die Analyse der PKC-Expressionmuster in Endothel- und glatten Muskelzellen humaner Koronararterien legt den Schluss nahe, dass die PKC-abhängigen Signalwege in diesen anatomisch eng benachbarten Zelltypen ähnlich reguliert werden.

Aims: Apoptosis in vascular endothelial and smooth muscle cells plays a key role in the pathogenesis of atherosclerosis. Since Free Fatty Acids are known to induce apoptosis in various cell types, the effects of saturated and unsaturated fatty acids in HCAEC and HCASMC were studied. Statins have shown vasoprotective effects unrelated to cholesterol-lowering. Studies demonstrate pro-apoptotic as well as anti-apoptotic effects. Therefore, we studied the effects of the HMG-Co-A-Reductase-Inhibitor Atorvastatin on lipoapoptosis of HCAEC and HCASMC. Protein kinase C (PKC) - signalling is of importance in atherosclerosis as well as apoptosis. Hence we analysed the expression pattern of PKC in HCAEC and HCASMC and the effects of miscellaneous Protein Kinase C inhibitors on apoptosis.

Methods: Apoptosis was analysed using flow cytometric cell cycle analysis (quantification of apoptotic cells with sub-G1 DNA content). The expression pattern of PKC isoforms was determined by Western blotting with isoform-specific PKC antibodies and light cycler PCR. Intracellular PKC-distribution was detected with confocal laser scanning microscopy.

Results: The saturated fatty acids palmitate (C16:0) and stearate (C18:0) induced apoptosis in both HCAEC and HCASMC. The mono-unsaturated fatty acids palmitoleate (C16:1) and oleate (C18:1) showed no effect on apoptosis. The poly-unsaturated fatty acids Linoleat (C18:2) induced apoptosis in HCASMC. Palmitoleate, oleate and linoleate reduced the apoptosis-stimulating effect of palmitate in HCAEC and increased it in HCASMC. Atorvastatin showed no effect on FFA induced apoptosis in neither HCAEC nor HCASMC. The PKC-expression pattern was identical in HCAEC and HCASMC: PKC-alpha, -beta, -delta, -epsilon and -iota were detected, whereas no relevant protein amounts of PKC isoforms gamma, eta, theta and zeta were found. Long-term incubation with TPA (20 hrs, 500 nM) induced down-regulation of the conventional and novel PKCs.

Conclusions: Lipoapoptosis in HCAEC AND HCASMC is strongly dependent on the chain length of FFA. Inhibition of stearate-induced apoptosis by mono-unsaturated fatty acids might at least partly explain the vasoprotective effect of unsaturated fatty acids in a diet. The identical expression pattern of PKC in HCAEC and HCASMC suggests a similar regulation of PKC-dependant intracellular signalling in those anatomically closely linked cell types.

Abbreviations: FFA: Free Fatty Acids HCAEC: Human coronary artery endothelial cells HCASMC: Human coronary artery smooth muscle cells PKC: protein kinase C TPA: 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate