Untersuchung von Einzelbasensubstitutionen (SNPs) in Toll-like-Rezeptor-Genen mittels LightCycler Technologie bei Patienten nach allogener Knochenmark- oder Stammzelltransplantation im Zusammenhang mit der Analyse klinischer Risikofaktoren für eine C

Abstract

In dieser Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der Verteilung von definierten SNPs in den Toll-like-Rezeptoren 3, 8 und 9 und dem Risiko einer CMV-Reaktivierung bzw. Erkrankung nach allogener Stammzelltransplantation untersucht. Toll-like-Rezeptoren erkennen krankheitsassoziierte molekulare Muster. Sie sind an der Immunabwehr von Mikroorganismen und Viren beteiligt. TLR 3 erkennt doppelsträngige virale RNA, TLR 8 einzelsträngige RNA und TLR 9 agiert mit unmethylierten CpG-Motiven. Infektionen, die durch das Cytomegalievirus verursacht werden, stellen für Patienten nach Stammzelltransplantation trotz Fortschritten in Diagnostik und Therapie nach wie vor eine schwere Komplikation dar. Als Methode, die DNA auf Einzelbasensubstitutionen zu untersuchen, wurde die Schmelzkurvenanalyse mittels LightCycler Technologie gewählt. Sie zeichnet sich durch ihre einfache, genaue und reproduzierbare Art aus. Es wurden folgende für die SNPs spezifische Sonden hergestellt: rs5743318, rs3775291 (tlr3), rs2407992, rs3764880, rs3747414 (tlr8) und rs352140 (tlr9). Alle SNPs sind in Exons lokalisiert, rs5743318, rs3775291 und rs3764880 führen zu einem Aminosäureaustausch. Es wurden 95 Patienten mit CMV Reaktivierung, 26 Patienten mit einer CMV Erkrankung und 51 Patienten ohne CMV Reaktivierung untersucht. Es ergab sich kein signifikanter Unterschied in der SNP Häufigkeit für tlr3 und tlr9 zwischen Patienten mit und ohne CMV Reaktivierung. Die SNPs rs3764880, der zu einem Aminosäureaustausch von Methionin zu Valin an Aminosäureposition eins im TLR8 (p<0.05) Gen führt, rs3747414 und rs2407992 (synonymer Austausch) wurden öfter bei Patienten mit CMV Reaktivierung beobachtet, als bei Patienten ohne CMV Reaktivierung. Zudem wurde rs3747414 bei Patienten mit einer CMV Erkrankung (p<0.04) weniger oft detektiert als bei Patienten mit CMV Reaktivierung aber ohne Erkrankung. Wir vermuten, dass die erwähnten SNPs mit einer CMV Reaktivierung assoziiert sind und dass für eine CMV Erkrankung weitere Risikofaktoren wie Graft versus Host disease und Kortikosteroidbehandlung zusätzlich bedeutend sind. Der Ansatz dieses Projekts, die Untersuchung von single nucleotid polymorphisms in Toll-like Rezeptoren bei Patienten nach Stammzelltransplantation, im Zusammenhang mit dem Risiko einer CMV-Reaktivierung bzw. Erkrankung ist vielversprechend. In Zukunft sind weitere Projekte mit mehr Patienten und der SNP-Analyse in anderen TLR und in weiteren an der Immunabwehr bedeutsamen Komponenten anzustreben.

In order to investigate the influence of single nucleotide polymorphisms (SNP) for the risk to reactivate cytomegalovirus (CMV) infection and to develop CMV disease in patients after allogeneic stem cell transplantation (SCT), we screened the Toll Like Receptor (TLR) genes tlr3, tlr8 and tlr9 for the presence of defined SNP. TLR play a critical role in early innate immunity to invading pathogens by sensing microorganisms. TLR3 is implicated in virus-derived double-stranded RNA, TLR8 has been shown to recognize small synthetic antiviral molecules and TLR9 is required for response to unmethylated CpG DNA. CMV infection remains the most important herpesvirus infection in patients after SCT and is associated with a mortality of up to 30%. The SNPs were detected by melting curve analysis using the LightCycler technique. For each of the following SNP specific oligonucleotide probes were designed: rs5743318, rs3775291 (tlr3), rs2407992, rs3764880, rs3747414 (tlr8) and rs352140 (tlr9). All SNP are located in exons, rs5743318, rs3775291 and rs3764880 lead to amino acid exchanges. Ninety-five patients with CMV reactivation, 26 patients with CMV disease and 51 patients without CMV reactivation were screened for the presence of the above mentioned SNPs. The LightCycler assay allowed a fast, reproducible and reliable detection of all SNP in all patient samples. There was no significant difference in the frequency of SNP in tlr3 and tlr9 between patients with and without CMV reactivation. However, rs3764880 leading to an amino acid exchange from methionin to valin at amino acid position 1 of TLR8 (p<0.05), rs3747414 and rs2407992 (both synonymous change) were more often detected in patients with CMV reactivation compared to patients without CMV reactivation. In addition, rs3747414 was significantly less often detected in patients with CMV disease (p<0.04) compared to patients with CMV reactivation but without disease. In conclusion, we presume that the SNPs described might be associated with CMV reactivation. For CMV disease, further risk factors, such as graft versus host disease and corticosteroide treatment seem to be relevant.