Untersuchungen zur Interaktion von Coxsackievirus B3 mit dem Zytoskelett permissiver Wirtszellen im Verlauf der Infektion

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-23284
http://hdl.handle.net/10900/44827
Dokumentart: Dissertation
Date: 2006
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Sonstige
Advisor: Klingel, Karin
Day of Oral Examination: 2001-11-27
DDC Classifikation: 610 - Medicine and health
Keywords: Myokarditis , Actin , Virusinfektion , Zellskelett
Other Keywords: Coxsackievirus B3 , Aktin , Zytoskelett
Myocarditis , cytoskeleton , actin , virus infection , coxsackievirus B3
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Inhaltszusammenfassung:

Das Coxsackievirus B3 (CVB3) ist ein kardiotropes Enterovirus aus der Familie der Picornaviren. Es gilt als wichtigster Erreger viraler Herzerkrankungen, insbesondere der viralen Myokarditis. Wird die akute Erkrankung überstanden, besteht die Möglichkeit der Entstehung einer chronischen Myokarditis, welche in einer dilatativen Kardiomyopathie und einer folgenden Herzinsuffizienz münden kann. Von vielen Viren ist bekannt, dass das Zytoskelett der infizierten Zelle im Rahmen der viralen Replikation in seiner Struktur grundlegend verändert wird. Es gibt Hinweise dafür, dass bei der Poliovirusinfektion das Zytoskelett modifiziert wird und ein grundlegendes zelluläres Kompartiment der Virusreplikation darstellt. Im Gegensatz zu Poliovirus ist über die Interaktion von CVB3 mit dem Zytoskelett der permissiven Zielzelle bislang nur sehr wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum Verständnis der Virus-Wirt-Interaktion unter besonderer Berücksichtigung des Zytoskelettes bei der CVB3-Infektion zu leisten. Es konnte gezeigt werden, dass in CVB3-infizierten HeLa-Zellen die Intermediärfilamente Keratin und Vimentin keine geordnete Struktur mehr, sondern eine Verklumpung im Bereich der Zellmitte aufweisen. Das im uninfizierten Zustand sehr feine Tubulingerüst der HeLa-Zellen verdichtet sich im Verlauf der CVB3-Infektion zu einer homogenen Masse. Das F-Aktingerüst wird völlig fragmentiert und findet sich verklumpt am Zellrand wieder. Bezüglich des zeitlichen Verlaufes der F-Aktinschädigung findet man den Zusammenbruch des F-Aktingerüsts erst 2 bis 3 Stunden pi, einem Zeitraum, der mit der Synthese viraler Proteine korreliert. Untersucht man diese Zytoskelettveränderungen hinsichtlich ihrer Spezifität für die Virusinfektion, so zeigt sich, dass nur der Zusammenbruch des F-Aktingerüsts ein spezifisches Phänomen im Rahmen der Virusreplikation darstellt, während die Veränderungen der Organisation des Keratins, Vimentins und Tubulins vielmehr als virusinduzierte Stressreaktionen der Zelle anzusehen sind, welche sich in ähnlicher Form auch nach Behandlung der Zellen mit thermischen/chemischen Reizen induzieren lassen. Zur Übertragung der anhand CVB3-infizierter HeLa-Zellen beobachteten Veränderungen des F-Aktins auf das in vivo Mausmodell der CVB3-Myokarditis konnten wir 4 Tage pi deutlich aktinreduzierte Bezirke als infizierte Myozyten im Myokard der Tiere identifizieren. Zur Überprüfung der Abhängigkeit der viralen Replikation vom Zytoskelett der infizierten Zielzelle wurden einzelne Zytoskelettanteile durch verschiedene Substanzen spezifisch zerstört und die Effizienz der viralen Replikation mittels in situ Hybridisierung, Immunfluoreszenzmikroskopie sowie durch Ein-Schritt-Wachstumskurven überprüft. Infolge der gezielten Zerstörung des F-Aktingerüstes durch Cytochalasin D konnte ein verzögerter Titeranstieg sowie ein erniedrigter Virustiter in den Ein-Schritt-Wachstumskurven nachgewiesen werden. Die Zerstörung des Keratin-, Vimentin- oder Tubulingerüsts hingegen hatte keinen nachweisbaren Einfluss auf die Virusreplikation. Inwieweit ein Calciumeinstrom in die Zelle oder eine Entleerung der intrazellulären Calciumspeicher den viralen zytopathischen Effekt induziert, wurde zum einen durch Infektion unter calciumfreien Bedingungen mit und ohne vorherigen Entleerung der intrazellulären Calciumspeicher durch Thapsigargin und zum anderen durch Blockade der L-Calciumkanäle durch Verapamil überprüft. Unter keiner dieser Untersuchungsbedingungen konnte der Zusammenbruch des F-Aktingerüsts verhindert werden. In weiteren Untersuchungen wurde die Abhängigkeit der CVB3-Replikation vom Golgiapparat der Zielzelle überprüft. Hierzu wurde die Funktion des Golgiapparates mittels Brefeldin A blockiert. Unter Brefeldin A Zugabe kommt es zu einer vollständigen Inhibierung der Synthese viraler RNA, es ließ sich kein virales Protein nachweisen und auch die Schädigung des Zytoskeletts blieb aus. Gibt man Brefeldin A erst 2.5 Stunden pi dem Medium zu, so ist keine Inhibierung der Synthese viraler RNA mehr zu beobachten und auch die Aktinschädigung ist vergleichbar mit derjenigen bei CVB3-Infektion ohne Zugabe von Brefeldin A. Zusammenfassend kann geschlossen werden, dass bei der CVB3-Infektion das Aktingerüst der Zielzelle eine wichtige Funktion im Rahmen der Virusreplikation übernimmt und hierbei spezifisch zerstört wird. Calcium ist für die Zytopathogenität allenfalls von sekundärer Bedeutung. Die Zerstörung des Aktingerüsts kann auch in vivo am Mausmodell der CVB3-Myokarditis nachgewiesen werden und erfolgt im Rahmen der viralen Proteinsynthese vermutlich durch die Proteinase 2A von CVB3. Durch eine chemische Zerstörung des F-Aktingerüsts wird die virale Replikation deutlich vermindert, jedoch nicht vollständig inhibiert. Eine vollständige Inhibierung der Virusreplikation lässt sich aber durch die Blockierung des Golgiapparats erreichen, welcher für die virale RNA Synthese eine entscheidende Rolle spielt.

Abstract:

folgt

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