Quantitativer PCR-Nachweis zur Bestimmung der Expression von Zytokin-, Chemokin-, Toll-like Rezeptor- und Adapterprotein-Genen nach Stimulation von peripheren mononuklearen Blutzellen mit Lipopolysacchariden und Phythämagglutinin

Abstract

In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob es nach Stimulation von humanen peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMCs) mit Lipopolysacchariden (LPS) oder Phythämagglutinin (PHA) zu einer Veränderung der Expressionsrate von spezifischen Zytokin-, Chemokin-, TLR- und Adapterprotein- Genen gekommen ist. Hierbei wurde die Technik der real-time RT-PCR angewendet, die sich durch ihre leichte Durchführbarkeit, hohe Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit auszeichnet. Die im Labor hergestellten Standardverdünnungsreihen zeigten eine Reproduzierbarkeit, die sich mit denen anderer real-time RT-PCR Assays aus der Literatur deckt. Des Weiteren konnte für alle untersuchten Zytokin-, Chemokin-, TLR- und Adapterprotein-Gene ein sehr hohes Detektionslimit erzielt werden (MyD88: 102; IL-15 und RANTES: 101; TLR3, IRAK1 und TRAF6: 100). Die verwendeten Hybridisierungssonden erlaubten außerdem eine hoch- spezifische PCR-Produkt Detektion, was durch die gelelektrophoretische Auftrennung der TRAF6 LightCycler-PCR-Produkte eindrücklich gezeigt werden konnte. Auch konnte gezeigt werden, dass mit dem in dieser Arbeit verwendeten PCR-Assay eine hohe Intra- und Inter-Reproduzierbarkeit erreicht werden kann. Auch war über einen Bereich von 6 Zehnerpotenzen die Linearität der Amplifikation gegeben. Nach LPS-Stimulation konnte gezeigt werden, dass MyD88, IRAK1 und TRAF6, die alle Schlüsselrollen beim LPS-induzierten Signalweg einnehmen, eine erhöhte Genexpressionsrate aufwiesen. IL-15, das bedeutend bei der antiviralen Immunantwort ist, RANTES und TLR3, welches für die Erkennung doppelsträngiger RNA von Viren verantwortlich ist, zeigten hingegen keinen erhöhten Expressionslevel. Es stellt sich jedoch als schwierig heraus, die Ergebnisse aus der Literatur mit den eigenen Ergebnissen zu vergleichen, da eigentlich nie die identischen Versuchsbedingungen (Art der stimulierten Zellen, Stimulationsdauer und Stärke des stimulierenden Agens) vorliegen und es deshalb zu unterschiedlichen Genexpressionen kommen kann.

In this dissertation the technique of real-time RT-PCR was used to show if there is a change of the gene expression of specific cytokines, chemokines, toll-like receptors and adapter proteins in LPS- and PHA-stimulated human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in comparison to non-stimulated PBMCs. The real-time RT-PCR is a rapid, standardized, sensitive, reproducible and accurate method for in vitro quantification of specific cDNA. The external standards were produced in our lab and showed a reproducibility, that can be compared with external standard reproducibility from other authors. A high detection limit could be achieved ( MyD88: 102, IL-15 and RANTES: 101; TLR3, IRAK1 and TRAF6: 100). With the hybridization probes a high specific PCR detection was achieved. This could be demonstrated in a gel electrophoretic assay with TRAF6- PCR products of all concentrations (106-101). The PCR assay permitted a high intra- and interreproducibility. The amplification was linear in a sector from 101-106. After stimulation with lipopolysaccharide the PBMC showed an increased expression level of MyD88, IRAK1 and TRAF6. All these mediators play a crucial role in the LPS induced pathway. LPS stimulation had no influence on the expression of IL-15, RANTES and TLR3, which play an important role in the antiviral immune response. All in all it is difficult to compare these results with the results from other authors, because of the different experimental conditions (type of stimulated cells, duration of stimulation, stimulant power).