Neuronale Aktivierung im Nucleus Tractus Solitarius nach intrajejunaler und systemischer Lipopolysaccharidgabe im Dünndarm der Ratte

Abstract

Einleitung: Systemisches LPS sensibilisiert mesenterische afferente Nervenfasern im Intestinum der Ratte, wobei die Cycloxigenase aktivierende und NO hemmende Wirkung besitzt. (Gastroenterology 2003; 124: M1298). Intestinale Entzündungsvorgänge können über eine Mastzellaktivierung Fos-positive Neurone des Nucleus Tractus Solitarius (NTS) im Hirnstamm aktivieren (Neuroscience Letters 2000; 289: 45-48). Wir stellten die Hypothese auf, dass afferente Signale nach intrajejunaler und systemischer Lipopolysaccharidgabe (LPS) in den NTS weitergeleitet werden und diese neuronale Aktivierung im Hirnstamm pharmakologisch beeinflussbar sei.

Methoden: Die Experimente wurden an männlichen Wistar-Ratten (300-400 g) durchgeführt. Hierbei wurde vier Tage nach operativer Anlage eines Jejunalkatheters E.coli-LPS entweder lokal über den Katheter (10 mg ml-1, Volumen: 2 ml, Dauer: 3h) oder systemisch als Bolus durch intraperitoneale Injektion (1 mg kg-1) appliziert. Zur Untersuchung der pharmakologischen Beeinflussbarkeit der neuronalen Aktivierung im Hirnstamm wurde in Subgruppen vor systemischer LPS-Gabe der Cyclooxigenasehemmer Naproxen (10 mg kg-1) oder der iNOS-Inhibitor Aminoguanidin (15 mg kg-1) intraperitoneal appliziert. Drei Stunden nach Abschluss der LPS-Gabe erfolgte die Gabe einer Pentobarbitalüberdosierung und die Blutprobengewinnung zur Bestimmung der Serum-LPS Konzentration mittels LAL-Chromogenic Endpoint Assay. Nachfolgend Perfusion des Tieres mit NaCl- und Formalinlösung sowie Entnahme des Gehirns zur immunohistochemischen Untersuchung. Die neuronale Aktivierung im NTS wurde mittels c-Fos-Immunohistochemie in den Höhen 13.3 mm, 13.8 mm und 14.3 mm kaudal des Bregma, die Area postrema 13.8 mm kaudal des Bregma untersucht. Die Auswertung erfolgte als Mittelwert ± SEM mittels One-Way ANOVA und nachfolgendem Student-Newman-Keuls-Test.

Ergebnisse: Die Gabe von intrajejunal appliziertem LPS führte zu einer Zunahme der Anzahl Fos-positiver Zellen auf 91 ± 12 (n=7, p<0.05) im Vergleich zur Kontrolle (Trägerlösung: 0.9% NaCl) mit 39 ± 9 (n=8). Nach systemischer LPS-Gabe betrug die Anzahl Fos-positiver Zellen 152 ± 25 (n=6, p<0.05) im Vergleich zur Kontrollsubstanz mit 52 ± 6 (n=7). Die Vorbehandlung mit Naproxen führte zu keiner signifikanten Abnahme der Anzahl Fos-positiver Zellen (99 ± 30; n=6, p>0.05). Nach Vorbehandlung mit Aminoguanidin betrug die Anzahl Fos-positiver Zellen 242 ± 66 (n=6; p<0.05). Die systemische Gabe von LPS führte im Gegensatz zur intrajejunalen Gabe (26.6 ± 4.5, n=7, p>0.05) zur Zunahme der Anzahl Fos-positiver Zellen in der Area postrema auf 96.5 ± 17.4 (n=6, p<0.05) im Vergleich zur Kontrolle mit 13.7 ± 3.8 (n=6). Die systemische Gabe von LPS zeigte im Gegensatz zur intrajejunalen Gabe (68 ± 42 pg ml-1; n=5, p>0.05) eine deutliche Zunahme der Serum-LPS Konzentration auf 492810 ± 207162 pg ml-1 (n=6, p<0.05) im Vergleich zur Kontrolle (34 ± 9 pg ml-1, n=7).

Schlussfolgerungen: In Zusammenschau der Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass die Aktivierung von Neuronen im NTS nach LPS-Gabe wahrscheinlich durch direkte Interaktion mit darmassoziierten Neuronen erfolgt. Weiterhin ist anzunehmen, dass eine relevante systemische Aufnahme von LPS nach intrajejunaler Applikation unwahrscheinlich erscheint und nicht zur zentralen Aktivierung beiträgt. Zur pharmakologischen Beeinflussbarkeit lässt sich aus den vorliegenden Daten ableiten, dass in der Regulation dieser Prozesse NO einen hemmenden Effekt auf die Bildung von Fos-Protein nach LPS-Gabe hat, während sich ein permissiver Effekt der Cyclooxigenase nicht eindeutig nachweisen liess.

Introduction: Systemic LPS sensitizes mesenteric afferents in the rat small intestine with up-regulation via a cyclooxygenase and down-regulation via a NO mediated mechanism (Gastroenterology 2003; 124:M1298). Brain stem neurons in the NTS are activated following intestinal mast cell mediated inflammatory responses (Neuroscience Letters 2000; 289: 45-48). We hypothesized that afferent signals following LPS are relayed to the CNS and that neuronal activation in the brain stem is modulated by the mechanisms.

Methods: Male Wistar rats (300-400g) were anesthetized and equipped with a jejunal canula that was exteriorized at the animals´ neck. 4 days later, animals received LPS from E. coli either via the indwelling canula into the jejunum (20 mg / 3h) or – for pharmacological studies as the activation in the CNS was more robust - as a bolus i.p. (1 mg kg-1). Three hours after LPS administration was terminated, animals were sacrificed, perfused with normal buffered saline and the brain removed. Neuronal Fos-protein synthesis was determined by immunohistochemical staining. Fos positive cells in the nucleus tractus solitarius (NTS) were counted at 13.3, 13.8 and 14.3 mm from bregma. Serum-LPS levels were determined by LAL Chromogenic Endpoint Assay. Data are mean ± SEM. Groups were sized 6-8 animals and compared by One-way-ANOVA followed by posthoc Student-Newman-Keuls Analysis.

Results: Following luminal LPS perfusion, 91±12 Fos positive cells were counted in the NTS compared to 39±9 in controls receiving normal saline (p<0.05). The number of Fos positive cells was increased following systemic LPS administration compared to vehicle treated controls (150±25 following LPS vs. 52±6 in controls; p<0.05). Fos positive cells were increased to 242±66 in the brain stem of animals pretreated with the iNOS inhibitor aminoguanidine (15 mg kg-1; p<0.05 vs. controls). Following previous administration of the cyclooxygenase inhibitor naproxen (10 mg kg-1), the number of Fos-positive cells was 99±30 which was not different compared to controls. LPS-levels were increased to 493x103 ± 207x103 pg ml-1 (n=6) in the serum of animals that were treated with systemic LPS compared to 34 ± 9 pg ml-1 in vehicle controls (n=7, p<0.001, Fig.4).

Conclusions: Systemic and intrajejunal LPS trigger neuronal activation in the rat brain stem. Potentially, afferent impulse traffic in the small intestine is relayed to the CNS. However, other factors like a direct effect of LPS on brain stem neurons may also be involved. The modulatory mechanisms may be similar to those shown previously for mesenteric afferents.