Zytotoxizität von 6-Fluordopamin gegenüber Noradrenalin-Transporter positiven und negativen Neuroblastomzellen im Vergleich zu hämatopoetischen Stammzellen

Abstract

Das Neuroblastom ist der zweithäufigste solide Tumor des Kindesalters. In fortgeschrittenen Stadien befällt er meist das Knochenmark und hat dann trotz Hochdosischemotherpie mit autologer Stammzelltransplantation eine ungünstige Prognose. Charakteristisch an den Neuroblastomzellen ist ihre Katecholaminsynthese und die Tatsache, dass sie den Noradrenalin-Transporter besitzen. Mit 6-Fluordopamin wurde eine Substanz entwickelt, die selektiv vom Noradrenalintransporter aufgenommen werden kann und in der Zelle über die Zwischenstufe 6-Hydroxydopamin in sein Chinon zerfällt und reaktive Sauerstoffverbindungen freisetzt, die ein Absterben der Zelle bewirken. Dieser Prozess kann theoretisch durch Reduktionsmittel wie Ascorbat verzögert werden, wodurch die Aufnahme von 6-Fluordopamin in die Zelle erhöht werden kann. Bei der Durchführung der Arbeit zeigte sich, dass 6-Fluordopamin nach einer einstündigen Einwirkzeit tatsächlich nur für die Neuroblastomzellen toxisch war, die den Noradrenalin-Transporter besaßen. Neuroblastomzellen ohne Noradrenalin-Transporter wurden hingegen wenig beeinträchtigt. Allerdings hatte 6-Fluordopamin auf das Wachstum und die Koloniebildung von hämatopoetischen Stammzellen eine stark hemmende Wirkung. Dies kann eventuell dadurch erklärt werden, dass 6-Fluordopamin über den Dopamin-Transporter der hämatopoetischen Stammzellen aufgenommen wird. Durch Zugabe von Ascorbat wurde die Freisetzung reaktiver Sauerstoffverbindungen so deutlich reduziert, dass es zu keiner wesentlichen Wachstumshemmung mehr kam. Letztendlich haben die Ergebnisse dieser Untersuchung zum Schluß geführt, das ursprünglich vorgesehene Konzept der Verwendung von 6-FDA zur Therapie des Neuroblastoms zu verwenden, fallen zu lassen. Erstaunlicherweise zeigten jedoch die hämatopoetischen Stammzellen, die zu Vergleichszwecken ausschließlich mit Ascorbat behandelt wurden ein höheres Koloniewachstum als die Kontrollgruppe. Da das Koloniewachstum mit der Regenerationsfähigkeit des reinfundierten autologen Knochenmarks nach Hochdosischemotherapie korrelliert, könnte Ascorbat in vivo womöglich die Regenerationsfähigkeit des Knochenmarks nach Hochdosischemotherapie steigern. Mit Blick auf die klinische Anwendung - die Gabe von Ascorbat ist nebenwirkungsarm und ein schnelleres Anwachsen der hämatopoetischen Stammzellen kann das Risiko schwerer Nebenwirkungen wie Infektionen vermindern - sind weitere Untersuchungen dazu aussichtsreich.

Neuroblastoma is the second most common malignant tumour in children before the age of 6. In advanced stages it usually affects bone marrow and has an unfavourable prognosis, in spite of high-dose chemotherapy and autologous stem cell transplantation. Characteristically, neuroblastoma cells produce catecholamines and some express the noradrenaline transporter. The catecholamine-analogous substance 6-fluorodopamine (6-FDA) is selectively transported into neuroblastoma cells by the noradrenaline and/or dopamine transporter. Within the cell it can be transformed to 6-hydroxydopamine (6-OHDA), a highly cytotoxic compound which produces reactive oxygen compounds. If neuroblastoma cells are incubated in vitro with 6-FDA, parts of it are transformed to 6-OHDA before a significant portion can be taken up by the catecholamine transport systems. This process can be delayed in the presence of ascorbate. Therefore, the time to incorporate 6-fluorodopamine can be prolongued. It was speculated to use 6-FDA for purging of bone marrow cells from contaminating neuroblastoma cells prior to autologous bone marrow transplantation. Experiments presented in this doctoral thesis showed, that 6-fluorodopamine was cytotoxic to neuroblastoma cells expressing the noradrenaline transporter after one hour incubation time in vitro. Neuroblastoma cells not expressing the noradrenaline transporter were less sensitive. Unexpectely, 6-fluorodopamine strongly reduced the growth and colony building capacity of hematopoetic stem cells,too. The reason for these strong effects are unknown. Recently, it was shown by several research groups, that also hematopoetic cells can express catecholamine transporters and, therefore, they sould also be able to take up 6-FDA. The effect of ascorbic acid was dose-dependent. Using relative small concentrations (10-25µM), ascorbate prevented the transformation of 6-FDA to 6-OHDA outside the cells and, therefore, led to a more selective cytotoxicity on neuroblastoma cells expressing the catecholamine transporter. However, by using higher concentrations (~100µM) ascorbic acid was able to prevent the cytotoxicity on catecholamine transporters expressing neuroblastoma cells- as well as on neuroblastoma cells lacking transporter expression. Due to the results obtained by these investigations, we rejected the concept for using 6-FDA for bone marrow purging from neuroblastoma cells. Amazingly, hematopoetic stem cells which were treated with ascorbate in the course of our investigations grew better and formed more hematopoetic colonies than the control groups. Since colony formation in vitro correlates with the ability of hematopoetic stem cells to regenerate bone marrow after autologous stem cell transplantation, ascorbate may also increase the regeneration of bone marrow cells in vivo.