Untersuchungen zur Pathophysiologie der Cystinurie Typ A: Elektrophysiologische Charakterisierung des hrBAT Wildtyps und der Mutation T216M in Xenopus Oozyten

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-21985
http://hdl.handle.net/10900/44788
Dokumentart: Dissertation
Date: 2006
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Sonstige
Advisor: Lang, Florian
Day of Oral Examination: 2003-11-12
DDC Classifikation: 610 - Medicine and health
Keywords: Zystinurie , Proximaler Tubulus
Other Keywords: Cystinurie , Heteromere Aminosäuretransporter , rBAT , Xenopus laevis Oozyten
Cystinuria , heteromeric aminoacid transporter , rBAT , proximal tubule , xenopus laevis oocytes
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Inhaltszusammenfassung:

Die beiden Membranproteine rBAT und b0,+AT bilden als Heteromer einen funktionellen Aminosäuretransporter. Der hierbei induzierte Transport entspricht dem zuvor beschriebenen Aminosäuretransportsystem b0,+, bei dem dibasische und neutrale Aminosäuren sowie Cystin im Verhältnis 1:1 ausgetauscht werden. Der Einstrom von dibasischen Aminosäuren und Cystin in die Zelle wird bei diesem Austausch bevorzugt. Dadurch fungiert das Heteromer rBAT-b0,+AT als Teil des Mechanismus, der die Rückresorption dieser Substrate im proximalen Tubulus der Niere und deren Absorption im Dünndarm ermöglicht. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst die Eigenschaften des durch Expression des humanen rBAT in Xenopus laevis Oozyten induzierten Aminosäuretransports mittels der Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp Methode elektrophysiologisch untersucht. Alle geprüften dibasischen Aminosäuren einschließlich Cystin, sowie die meisten neutralen Aminosäuren induzierten Ströme in rBAT exprimierenden Oozyten. Die unterschiedliche Polarität dieser Ströme und die Untersuchungen zur Spannungsabhängigkeit und intrazellulären Vorbeladung zeigten für den humanen rBAT Aminosäureaustausch im Verhältnis 1:1, wie zuvor an rBAT anderer Spezies beschrieben. Die kinetischen Studien zu Substrataffinitäten ergaben hohe extrazelluläre Affinitäten für die dibasischen Aminosäuren und Cystin sowie niedrigere Affinitäten für die neutralen Aminosäuren. Bis auf die hierbei beobachtete leichte Natrium-Abhängigkeit entsprechen diese Ergebnisse den für das Transportsystem b0,+ beschriebenen Eigenschaften und bestätigen die Induktion dieses Transportsystems durch rBAT. Die Funktion des aus rBAT und b0,+AT bestehenden heteromeren Aminosäuretransporters ist essentiell für die Rückresorption von Cystin aus dem Primärharn. Daher können Mutationen in einem der beiden Proteine zum Krankheitsbild der Cystinurie führen. Wegen der schlechten Löslichkeit des Cystins treten bei Cystinurie rezidivierende Cystinsteine auf, die zu Obstruktionen, Harnwegsinfekten und bei fortschreitendem Krankheitsverlauf zur Niereninsuffizienz mit Dialysepflichtigkeit führen können. Eine der häufigsten bei Cystinuriepatienten in rBAT gefundene Mutationen führt zum Ersatz von Threonin durch Methionin an Position 216. In funktionellen Studien dieser Mutation in Xenopus laevis Oozyten zeigten sich sowohl in der Austauschfunktion als auch bei den extrazellulären Affinitäten für die verschiedenen Aminosäuren und Cystin keine Unterschiede zu den Transporteigenschaften des Wildtyp-Proteins. Die Resultate der Experimente zur Abhängigkeit der Expression von hrBAT von der Menge der cRNA sowie von der Zeitdauer nach deren Injektion zeigten jedoch für die Mutation T216M im Vergleich zum Wildtyp eine gestörte Expression. Somit führt die Mutation T216M zu einem gestörten Trafficking des Proteins zur Zellmembran, wie zuvor auch für andere Mutationen gezeigt werden konnte. An der Zellmembran ist das defekte Protein wie der Wildtyp funktionell aktiv, kann diese aber nicht im gleichen Ausmaß erreichen. Da auch die leichte Untereinheit b0,+AT nur in Anwesenheit der schweren Untereinheit rBAT an die Plasmamembran gelangen kann, verbleibt diese auch vermehrt intrazellulär. Dadurch ist in vivo der Transport von Cystin und der dibasischen Aminosäuren und damit deren Rückresorption aus dem Primärharn beeinträchtigt und erklärt bei den diese Mutation tragenden Patienten das Auftreten des Krankheitsbildes der Cystinurie.

Abstract:

The two membrane proteins rBAT and b0,+AT form a functional heteromeric amino acid transporter. The amino acid transport induced by this proteins corresponds to the previously described amino acid transport system b0,+, which exhibits 1:1 exchange of neutral and dibasic amino acids as well as cystine favouring the influx of dibasic amino acids and cystine into the cell. The heteromer rBAT-b0,+AT acts thereby as part of the mechanism which allows reabsorption of these substrates in the kidney proximal tubule and its absorption along the small intestine. In the present work the properties of the amino acid transport induced by the expression of the human rBAT in Xenopus laevis oocytes were examined using the two-electrode-voltage-clamp technique. All studied dibasic amino acids including cystine as well as most of the neutral amino acids induced currents in oocytes expressing rBAT. The opposed polarity of these currents and the studies on voltage dependence and intracellular preload demonstrated an amino acid exchange at the rate of 1:1 for human rBAT, as it was previously shown for rBAT of other species. The kinetic studies on substrate affinities resulted in high extracellular affinities for dibasic amino acids and cystine as well as lower affinities for neutral amino acids. Apart from the observed slight sodium-dependence these results correspond to the described properties of the transport system b0,+ and confirm the induction of this transport system by rBAT. The function of the heteromeric amino acid transporter formed by rBAT and b0,+AT is essential for the reabsorption of cystine out of the primary urine. Therefore, mutations in each of these two proteins can lead to cystinuria. Due to the low solubility of cystine, recurring cystine stones are formed and cause obstructions, urinary tract infections and later renal insufficiency with necessity to dialysis treatment. One of the most frequent mutations found in patients with cystinuria leads to the replacement of threonine by methionine at position 216. Functional studies of this mutation in Xenopus laevis oocytes revealed no differences compared to the wildtype protein regarding both the exchange function and the extracellular affinities for the studied amino acids. However, the experiments examining the dependence of hrBAT expression on the amount of cRNA or the time point after its injection resulted in a reduced expression compared to the wildtype protein. In summary, the mutation T216M leads to an impaired protein trafficking to the cell membrane as it was previously shown for other mutations. At the cell membrane, the defective protein is functionally active as the wildtype protein, but it is unable to reach the surface to the same extent. Hence, the light subunit b0,+AT which reaches the plasma membrane only in presence of the heavy subunit rBAT remains likewise mostly inside the cell. Therefore, the transport of cystine and the dibasic amino acids which is in vivo necessary for their reabsorption out of primary urine is impaired and explains the presence of cystinuria in patients carrying this mutation.

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