Vergleichende Sequenzanalyse der Tegumentproteine UL24, UL32, UL48, UL128-131A bei humanen Cytomegalovirusvarianten mit unterschiedlichem Zelltropismus

Abstract

Stämme des menschlichen Cytomegalovirus (HCMV) zeigen genetisch determinierte Unterschiede im Zelltropismus. Auch Veränderungen im Zelltropismus im Rahmen der Zellkulturadaptation von HCMV-Stämmen sind mit Veränderungen der DNA assoziiert. Der entscheidende Schritt im Replikationszyklus ist hierbei, mit welcher Effizienz die Viruspartikel von HCMV-Stämmen nach der Penetration zum Zellkern transportiert werden. Der Phänotyp wird demnach durch Strukturproteine vermittelt, also Kapsidproteine, durch kapsidassoziierte Tegumentproteine oder Hüllproteine. In dieser Arbeit wurden Tegumentproteine, die durch die viralen Leserahmen UL24, UL32, UL48 und UL128-131A von HCMV-Stämmen mit unterschiedlichem Zelltropismus durch Sequenzierung verglichen, um so Informationen über ihre mögliche Bedeutung für den Zelltropismus von HCMV zu erhalten. Eine weitere wesentliche Aufgabe in dieser Arbeit war geeignete Stämme für den Sequenzvergleich auszuwählen. Es ist bekannt, dass ein direkter Sequenzvergleich zweier beliebiger HCMV-Stämme eine Vielzahl von Unterschieden in nahezu jedem untersuchten Gen aufweist, ohne dass diese für den Phänotyp bedeutsam wären. Daher wurden für diese Arbeit HCMV-Varianten gewählt, welche einen unterschiedlichen Phänotyp aufweisen und genetisch so eng verwandt sind, dass der a priori Gen-Polymorphismus so gering wie möglich ist. So stammen die untersuchten Stämme 40E und 40F nicht nur aus einem Patientenisolat, sondern wurden aus einem genetisch homogenen plaquegereinigten Viruspräparat aufgrund ihrer Unterschiede im Endothelzelltropismus selektioniert. Ein wesentliches Ergebnis dieser Arbeit ist, dass die in UL24 und UL48 kodierten Proteine im untersuchten Isolatpaar HCMV 40E/F aufgrund der Sequenzgleichheit als Ursache für den unterschiedlichen Zelltropismus dieser beiden Stämme ausgeschlossen werden können. Im Leserahmen UL32 hingegen wurde ein Unterschied in der Basensequenz gefunden, welcher möglicherweise für den unterschiedlichen Zelltropismus der beiden Stämme mitverantwortlich sein könnte. Auch in der Genregion UL128-131A wiesen HCMV 40E und HCMV 40F Polymorphismen auf, die im Bereich des UL128-Genes mit einer Rolle für die beobachteten Zelltropismusunterschiede vereinbar sind. Mit einem Konservierungsgrad von 97,2% in UL128, 97,7% in UL130 und 97,8% in UL131A zwischen HCMV 40E/F einerseits und HCMV AD169 andererseits war die genetische Stabilität aller drei Leserahmen weitaus geringer als bei den zuvor analysierten Leserahmen UL24, UL32 und UL48. Während ein einzelner Basenaustausch in UL131A sich nicht auf Aminosäureebene auswirkte, führt ein Basenaustauch in UL130 zu einem Aminosäureaustausch eines unpolaren Cysteins bei HCMV 40E durch ein polares Serin bei HCMV 40F an Position 207. Dies ist aber nicht geeinget den Unterschied im Zelltropismus zu erklären, denn der nichtendotheliotrope Stamm AD169 hat an dieser Stelle wie der endotheliotrope Stamm 40E ein Cystein. Anders im Leserahmen UL128: HCMV 40E unterscheidet sich auf DNA-Ebene von HCMV 40F nur durch eine Deletion von 2 Basen. Dies hat aber eine dramatische Änderung des C-terminalen Proteinabschnitts zur Folge, da sich das Leseraster verschiebt. Somit entsprechen sich hier die nichtendotheliotope Stämme HCMV 40F und AD169, während beim endotheliotropen Stamm HCMV 40E die letzten 19 Aminosäuren fehlen und weitere 17 Aminosäuren verändert sind. Damit scheint im C-terminale Abschnitt des UL128-Proteins von HCMV 40E eine für den Endothelzelltropismus bedeutsame Funktion repräsentiert zu werden. Insgesamt wurden in dieser Arbeit zahlreiche Unterschiede im Vergleich zwischen dem Laborstamm AD169 und dem untersuchten Isolatpaar HCMV 40E/F gefunden, die die Annahme eines hohen genetischen a priori-Polymorphismus bei HCMV bestätigen. Die sehr eng verwandten HCMV-Stämme HCMV 40E und HCMV 40F zeigen im Gegensatz dazu eine weitgehende Übereinstimmung. Nur in zwei der sechs untersuchten Gene waren Änderungen der Aminosäuresequenz nachweisbar, die geeignet sind, die Unterschiede im Endothelzelltropismus zu erklären. Aufgrund dieser Ergebnisse hat sich das Isolatpaar HCMV 40E und HCMV 40F als ein geeignetes Zell-Virus-System bestätigt, um Unterschiede im Zelltropismus bei HCMV näher zu untersuchen. Die Bedeutung der Leserahmen UL32 und UL128 für die Ausprägung des Endothelzelltropismus von HCMV kann nun in weiterführenden phänotypischen Analysen geklärt werden.

Strains of the human cytomegalovirus (HCMV) show genetically determined differences in cell tropism. Changes in cell tropism under conditions of cell culture adaption of HCMV-strains are associated with differences in their DNA sequence. The critical step in the replication cycle of HCMV-strains in endothelial cells is the efficient transport of penetrated virus particles towards the cell nucleus. The phenotype is mediated therefore by structural proteins, i.e. particulary capsid proteins, capsid-associated tegument proteins and envelope proteins.

Selected structural protein-encoding viral open reading frames UL24, UL32, UL48 and UL128-131A of HCMV strains with different cell tropism were compared by sequence analyse, to gain informations about their possible significance for cell tropism of HCMV.

An important decision was to choose suitable strains for the comparison of their genome. It is common knowledge that the direct comparison of sequences of any two HCMV-strains shows a multitude of differences in almost every examinated gene without necessarily being important for the phenotype. Therefore we chose variants of HCMV that showed a different phenotyp but were genetically closely related to each other. In those strains the a priori- genetic-polymorphism is as low as possible. For that reason the examinated strains 40E and 40F were not only generated form a single patients blood but also from a single homogenous virus preparation which was plaque purified and then selected due to differences in endothelial cell tropism.

Due to a complete sequence identity in this study, the proteins encoded by UL24 and UL48 could be excluded as a reason for the difference in cell tropism in the examinated isolated couple of HCMV 40E/F. On the other hand we found a difference in the reading frame UL32, which could possibly be one of the reasons for differing cell tropisms of these both strains. In addition, HCMV 40E and HCMV 40F displayed a polymorphism in the gene region UL128-131A which could also play a role in the in cell tropism differences. The degree of conservation was 97,2% in UL128, 97,7% in UL130 and 97,8% in UL131A between HCMV 40E/F and HCMV AD169. Thus the genetic stability of these three reading frames was lower than the stabilitiy of the reading frames of UL24, UL32 and UL48. While a single exchange of one base in UL131A has no consequence concluding the resulting amino acid, a base exchange in UL130 leads to an amino acid change from an unpolar cysteine in HCMV 40E into a polar serine in HCMV 40F at position 207. But this fact does not explain the differences in cell tropism, because both strains, the non endothelial strain AD169 and the endothelial strains 40E, showed a cysteine. The examination of UL128 revealed a completely different picture: the DNA sequence differs in the deletion of two bases. This results in a dramatical change of the c-terminal part, because the reading frame changes. In consenquence the non endotheliotropic strains HCMV 40E and AD149 are similar regarding this region of the DNA but in the endothelial strain HCMV 40E lacks 19 amino acids and contains 17 differing amino acids. An important function for the endothelial tropism could thus be represented in the C-terminal part of UL128 HCMV 40E.

In conclusion high numbers of differences were found comparing the laboratory strain AD169 and the examinated couple of HCMV 40E/F, which confirm the hypothesis of a high genetic a-priori-polymorphism of HCMV. In contrast the very closely related strains HCMV 40E and HCMV 40F were shown to be genetically highly similar. Only two of the six examinated genes showed a difference in the amino acid sequence that could be responsible for the differences in endothelial tropism. Thus, this analysis could confirm HCMV 40E and HCMV 40F as a very useful cell-virus-system for examination of differences in cell tropism of HCMV. The importance of the reading frames UL 32 and UL128 for endothelial tropism of HCMV has now to be examinated in further phenotypical analyses.