Etablierung und Evaluation der NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)-Technologie zum Nachweis von Aspergillus-RNA

Abstract

Systemische Pilzinfektionen sind durch ihre stetige Zunahme in den letzten Jahren immer stärker ins Blickfeld gerückt; invasive Mykosen werden in diesem Zusammenhang in immer größerem Ausmaß von Aspergillus Spezies verursacht. Die Mortalität invasiver Aspergillosen ist außerordentlich hoch. Mittels dieser Arbeit sollte daher die Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA)-Technologie auf ihre Sensitivität, Spezifität und Robustheit beim Nachweis von Aspergillus Spezies hin untersucht werden. Außerdem wurden die Ergebnisse mit denen einer bereits etablierten Aspergillus-PCR verglichen. Ein weiteres Ziel war, eine erste Aussage bezüglich der klinischen Anwendbarkeit der Methode machen zu können. Als untere Nachweisgrenze für RNA aus Aspergillus Spezies konnte 1 CFU pro ml Blut gefunden werden, die NASBA-Sonde detektierte dabei zuverlässig RNA von Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus versicolor, Aspergillus glaucus und Aspergillus niger. Darüber hinaus zeigten sich Kreuzreaktionen der Sonde lediglich mit RNA von Penicillium brevicompactum, Penicillium chrysogenum und Alternaria alternata; Testreihen mit RNA von sechs weiteren Pilz Spezies, darunter Candida albicans, von Zytomegalovirus sowie von menschlichen Fibroblasten verblieben negativ. Damit werden mithilfe des NASBA-Verfahrens alle klinisch relevanten Aspergillus Spezies amplifiziert und detektiert. Weiterhin zeichnet sich die NASBA-Technologie durch einen hohen Grad an Robustheit aus, da in jedem von 28 Läufen mit einer bestimmten Zahl an Aspergillus-Konidien (106 bis 100 CFU) RNA detektiert werden konnte. Liegt eine Koinfektion mit zwei oder mehr unterschiedlichen Pilz Spezies vor, so erwiesen sich die Sensitivität sowie die Spezifität der Methode als unverändert. Zusätzlich stellte sich der Einsatz eines RNA-Schutzpuffers (RNA Secure) als wichtiges Hilfsmittel innerhalb des NASBA-Verfahrens heraus, um eine rasche Degradation im Probenmaterial zu verhindern. Im Vergleich zur PCR können einige Vorteile von NASBA beschrieben werden. Die NASBA-Technologie ist deutlich weniger fehleranfällig und benötigt einen geringeren zeitlichen Aufwand; ein Lauf kann bei NASBA innerhalb eines Arbeitstages durchgeführt werden. Darüber hinaus besitzt NASBA eine zehnmal höhere Sensitivität. Der Amplifikationsschritt wird auf einer gleichbleibenden Temperaturstufe ausgeführt, die PCR benötigt diesbezüglich mehrmalige rasche Temperaturwechsel. Des weiteren kann bei NASBA eine weitaus geringere Menge an Probenmaterial verwendet werden. Insgesamt kann festgehalten werden, daß die NASBA-Technologie in vielen Bereichen, sei es die Detektion von Pilzen, Viren oder Bakterien, erfolgversprechende Ergebnisse für viele klinische Anwendungsgebiete zeigt. Die Schnelligkeit, die hohe Sensitivität und Spezifität der Methode sowie der geringe Aufwand bei der Probengewinnung und die Zuverlässigkeit sind wichtige Punkte im Hinblick auf zukünftige Einsatzmöglichkeiten. Es besteht die Aussicht, dieses Verfahren in vielen Gebieten der Diagnostik einsetzen zu können. Allerdings ist NASBA häufig noch vollkommen unbekannt oder wird zumindest in der täglichen Routine nicht eingesetzt. Eine weitere intensive Forschung ist diesbezüglich sicherlich lohnenswert; hierdurch könnte diese Methode noch mehr Beachtung finden. Eine Arbeit zur Etablierung und Evaluierung von NASBA zum Nachweis von Pilz-RNA im Blut von immunsupprimierten Patienten wurde bereits durchgeführt.

Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), an isothermal amplification technique, was established and evaluated for the detection of Aspergillus RNA and compared with a previously published, well-defined real-time PCR assay amplifying a region of the Aspergillus 18S rRNA gene. NASBA showed a lower detection limit of 1 CFU and detected RNA from five different clinically relevant Aspergillus species, including Aspergillus fumigatus. All 77 blood samples tested by PCR and NASBA showed identical results in both assays. Results with the NASBA technique were obtained within 6 h. Thus, the NASBA technique provided a valuable tool for sensitive, specific, fast, and reliable detection of Aspergillus RNA with potential for routine diagnosis, including the possibility to test the viability of cells.