Untersuchungen zur Pathogenese der Huntington-Krankheit in transgenen Tiermodellen

Abstract

Die Chorea Huntington (HD) ist eine autosomal dominant vererbte, progredient verlaufende neurodegenerative Erkrankung. Trotz intensiver Forschungsbemühungen ist es bis heute nicht gelungen, die bei der HD verantwortlichen pathogenetischen Mechanismen gänzlich aufzuklären. Transgene Tiermodelle eröffnen neue Untersuchungsmöglichkeiten in vivo und ermöglichen so wichtige Erkenntnisse über die Pathogenese der Erkrankung. Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, verschiedene Aspekte der Pathogenese mit Hilfe transgener HD Tiermodelle zu untersuchen. Hierfür haben wir ein transgenes Rattenmodell für die humane HD generiert, welches den späten und langsam progredienten Verlauf der häufigsten Form der HD widerspiegelt. Die HD transgenen Ratten zeigen neuropathologische, neuroradiologische und neurochemische Veränderungen, die in ähnlicher Weise in HD Patienten auftreten. Überraschenderweise zeigte sich schon im ersten Lebensmonat eine erniedrigte Ängstlichkeit der transgenen Tiere sowie eine verbesserte Motorfunktion, welche daraufhin deuten, dass eine neuronale Dysfunktion bereits im ersten Lebensmonat oder sogar schon früher vorhanden ist. Die Motorkoordinationsfähigkeit war im Alter von 6 Monaten bei den HD Ratten signifikant schlechter als bei den Kontrolltieren. Kognitive Beeinträchtigungen traten im Alter von 9 Monaten in Form einer Arbeitsgedächtnisschwäche auf. Trotz neuer Nachweismethoden mit einer erhöhten Sensitivität konnten wir kein zeitliches neuropathologisches Korrelat zu den Verhaltensstörungen aufdecken. Htt-Aggregate und "Aggregation Foci" (AF) zeigten sich nicht vor dem 9. Lebensmonat, welches gegen ihre ursächliche Rolle für die frühen Verhaltensauffälligkeiten spricht. Dennoch ist die Rolle der htt-Aggregate weiterhin unklar. Mutiertes htt interagiert im Nukleus mit Transkriptionsfaktoren und es wurde vermutet, dass die intranukleären htt-Aggregate funktionell wichtige Proteine, wie z.B. Transkriptionsfaktoren rekrutieren und dadurch möglicherweise die Gentranskription entscheidend beeinträchtigen. Wir konnten zeigen, dass Transkriptionsfaktoren mit einer Polyglutamin-Domäne wie CBP, TBP oder SP1 nicht durch intranukleäre Einschlusskörperchen sequestriert werden, und es somit nicht zu einer Depletion der löslichen Form dieser Proteine kommt. Vielmehr könnte eine veränderte Interaktion des löslichen mutieren htt mit diesen Transkriptionsfaktoren zu einer beeinträchtigten Genexpression führen. Um die Funktion eines weiteren Interaktionspartners des htt zu untersuchen, haben wir ein HAP1 "knock-out" Mausmodell generiert. Die Ergebnisse unserer Studien lassen darauf schließen, dass HAP1 über eine Regulierung des EGFR Signalwegs wichtig für das Überleben hypothalamischer Neurone ist. Dies stimmt mit der normalen Verteilung von HAP1, welches besonders hoch im Hypothalamus exprimiert wird, überein. Der Untergang der Neurone im Hypothalamus, der eine wichtige Rolle im Essverhalten spielt, bewirkt wahrscheinlich eine inadäquate Antwort auf Hungerreize und führt dazu, dass die HAP (-/-) Mäuse nicht an Gewicht zunehmen und bis zum 15. Lebenstag versterben. Außerdem erbrachten wir Belege, dass mutiertes htt die Funktion von HAP1 und den EGFR Signalweg beeinträchtigt und so zur Neuro-degeneration im Hypothalamus führt. Viele Hinweise sprechen dafür, dass mutiertes htt erst nach einer proteolytischen Spaltung in den Zellkern gelangen, und damit erst toxisch werden kann. In einer anderen Studie untersuchten wir daher die Generierung N-terminaler htt-Fragmente in transgenen HD Mausgehirnen. Wir konnten zeigen, dass multiple N-terminale htt-Fragmente bereits in Gehirnen von jungen HD "knock-in" Mäusen generiert werden und dass ihre Akkumulation im Zellkern und die Formierung von Aggregaten durch den altersabhängigen Abfall der Proteasomenaktivität begünstigt wird. Diese zunehmende Ansammlung toxischer Fragmente ist mit der Progredienz der Erkrankung assoziiert. Da die Proteasomenaktivität in verschiedenen Hirnregionen in älteren Tieren und auch in Kontrolltieren verringert ist, erscheint es unwahrscheinlich, dass eine altersabhängige Abnahme der Proteasomenaktivität entscheidend zur spezifischen Neuropathologie in der HD beiträgt. Schlussfolgernd haben wir mit diesen Studien gezeigt, dass wir mit dem transgenen HD Rattenmodell ein geeignetes Werkzeug für Therapie- und Verlaufsstudien mit der Möglichkeit repetitiver neuroradiologischer Untersuchungen und für Untersuchungen, welche zur Aufklärung der Pathogenese dienen, haben. Des weiteren geben die Ergebnisse unserer Untersuchungen wichtige Hinweise für zukünftige Therapiestrategien. So sollten Therapieansätze zur Verhinderung pathologischer Interaktionen zwischen mutiertem htt und Transkriptionsfaktoren bereits vor der Bildung von Aggregaten erfolgen. Außerdem könnte möglicherweise die Wiederherstellung der normalen Funktion von HAP1 oder eine Verbesserung der Proteasomenfunktion in älteren Neuronen eine effektive Therapie für die HD darstellen.

Huntington's disease (HD) is an autosomal dominantly inherited neurodegenerative disorder which progresses until death. Despite intensive efforts, the exact mechanisms underlying the pathogenesis of HD are still unknown. Trangenic animal models provide unique possibilities to study the disease in vivo and therefore allow us to gain important insights into the pathogenesis of the disease. The main goal of this thesis was to investigate various aspects of the pathogenesis of HD using transgenic animal models of the disease. We therefore have generated a transgenic rat model of HD with 51 CAG repeats that resembles the common adult type of the disease. HD transgenic rats exhibit neuropathological and neurochemical changes similar to those seen in HD patients. Surprisingly, a reduced anxiety in transgenic animals was observed at the age of 1 month indicating that neuronal dysfunction already occurs at this young age or even earlier. Furthermore, motor coordination was impaired in HD rats at the age of 6 months compared to the control animals. Cognitive decline was detected at the age of 9 months, represented by a deteriorated working memory. Although using new and more sensitive methods to detect aggregates and 'aggregation foci' (AF), we were not able to find these neuropathological markers in significant numbers before the age of 9 months, which argues against a primary role of aggregates and AF in the earliest manifestations of the mutation. However, the relevance of Huntingtin (htt) aggregates in the pathogenesis of HD remains unclear. Mutant htt interacts with transcription factors in the nucleus and it has been proposed that intranuclear htt aggregates recruit important proteins such as transcription factors, thus possibly affecting gene expression. We were able to show that transcription factors with a polyglutamine domain such as CBP, TBP or SP1 were not sequestered by htt inclusions and therefore soluble forms of these transcription factors were not depleted. Our findings suggest that altered gene expression may result from the interactions of soluble mutant huntingtin with nuclear transcription factors, rather than from the depletion of transcription factors by nuclear inclusions. In order to study the function of another htt interacting protein we have generated HAP1 "knock-out" mice. The results of our studies indicate that HAP1 is essential for the survival of hypothalamic neurons via intracellular trafficking of epidermal growth factor receptor (EGFR). This is consistent with the normal distribution of HAP1 which is highly expressed in the hypothalamus. The loss of neurons in the hypothalamus, which plays an important role for feeding behavior, might cause an inadequate response to hunger and therefore mice lacking HAP1 die postnatally because of depressed feeding activity. There is considerable evidence that mutant htt only accumulates in the nucleus and becomes toxic after it is cleaved to form N-terminal fragments. In another study we therefore investigated the generation of N-terminal fragments in the brains of transgenic HD mice. We demonstrated that complex N-terminal mutant htt fragments were generated already in very young HD "knock-in" mouse brains and that the accumulation and aggregation of these htt fragments was associated with an age-dependent decrease in proteasome activity. Because proteasome activity also decreases in various tissues in aged animals, its age-dependent decrease is unlikely to critically contribute to the specific neuropathology in HD. Taken together, we have shown that our transgenic rat model of HD is highly suitable for testing therapeutic agents. The bigger size of rats compared to mice also allows us to perform repetitive in vivo imaging such as PET and therefore gives us a unique chance to follow up disease progression as well as effects of long-term treatment in vivo. Furthermore, we were able to provide important information for future therapeutic strategies. For example, therapeutic approaches aimed at preventing pathological interactions between transcription factors and mutant htt should start before the formation of aggregates. Additionally, restoring the normal function of HAP1 or promoting the function of proteasomes in aging neurons could be an effective therapy for HD.