Selektive Aktivierung von TNF-Rezeptor 1 am Tumor mittels bispezifischer Antikörper

Abstract

Tumor Nekrose Faktor (TNF) ist ein hoch potentes Zytokin mit beachtlicher Anti-Tumor Aktivität. Da eine systemische Applikation bisher durch die starken Nebenwirkungen verhindert wird, wurden viele Versuche unternommen, die Aktivierung des TNF-Rezeptor 1 (TNFR1) zielgerichtet zu vermitteln, um gesundes Gewebe vor den TNF vermittelten Effekten zu schützen. Dieses Ziel wurde jedoch bisher nicht hinreichend erreicht. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Generierung eines bispezifischen EpCAMxTNFR1-F(ab')2-Konstruktes. Fab'-Fragmente eines agonistischen Antikörpers gegen den murinen TNFR1 wurden chemisch mit einem anti-EpCAM-Fab’-Fragmenten hybridisiert. Wenn diese bispezifischen Konstrukte an EpCAM als Tumorantigen auf B16-Melanomzellen binden zeigen diese bereits bei 1ng/ml starke agonistische Aktivität, welche sowohl über eine Aktivierung von Kaspase 3 und 7 als auch über die Lyse von TNF sensitiven WEHI-164s Zellen nachgewiesen wurde. In Abwesenheit von EpCAM auf den B16 Zellen wurde erwartungsgemäß erst bei unphysiologisch hohen Konzentrationen (1000ng/ml) eine schwache Zellyse vermittelt. Daraufhin untersuchten wir die Aktivität des Konstruktes in einem B16 Melanom Mausmodell mit syngenen, immunkompetenten Mäusen. Hierfür wurden C57Bl/6 Mäusen jeweils 2.500 EpCAM transfizierte B16 Melanom Zellen i.p. injiziert und die Tiere nachfolgend mit 6 x 20µg des bispezifischen Konstruktes behandelt. Während alle sechs behandelten Mäuse überlebten, starben in der Kontroll-Gruppe fünf von sechs Mäusen innerhalb von 10 Wochen. In der behandelten Gruppe wurden keine signifikanten Nebenwirkungen beobachtet. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die Aktivität des EpCAMxTNFR1-F(ab')2-Konstruktes strikt von der Anwesenheit des Zielantigens EpCAM auf Tumorzellen abhängig ist und das Konstrukt folglich signifikante lokal begrenzte Anti-Tumor Effekte vermittelt. Damit ist die Basis für eine weitere tierexperimentelle Erprobung der bispezifischen F(ab')2-Fragmente als Grundlage für eine experimentelle klinische Erprobung derartiger Reagenzien an Patienten mit malignen Erkrankungen geschaffen.

Tumor necrosis factor (TNF) is a highly effective cytokine with considerable anti tumor activity not only because of direct tumoricidal effects but also due to its strong inflammatory and anti-angiogenic properties. However, while impressive clinical responses were obtained by locoregional application, e.g. in isolated limb perfusion, systemic application of TNF causes intolerable side effects. Therefore, multiple attempts have aimed for targeted delivery of TNF to maximize therapeutic efficiency and sparing normal tissue from detrimental effects, e.g. by generating antibody-derived fusion proteins with human TNF replacing the IgG1 CH2/CH3 Fc domain. However, a highly selective and thus clinically applicable drug for stimulation of TNF-receptors (TNF-R) at the tumor site with minimal unspecific TNF-R stimulation is still not available. Here we report the generation of a bispecific EpCAM X TNFR1 Fab2 antibody (bsFab2). The Fab fragments of an agonistic antibody to mouse TNFR1 were chemically hybridized to anti-EpCAM Fab fragment which served as a targeting molecule on EpCAM transfected mouse melanoma cells. Bound to such cells the bsFab2 exerted strong TNF activity as measured by killing of TNF sensitive WEHI-164 cells at concentrations as low as 0.1ng/ml. In the presence of untransfected tumor cells weak killing was detectable only at antibody concentrations as high as 1000ng/ml. Even more, killing of WEHI-164 cells in the absence of tumor target cells was undetectable. This demonstrates that TNF activity is induced by the bsFab2 in a target cell restricted manner. Target cell restriction was also confirmed when caspase activation rather than cell death was measured. Next we investigated the activity of the bsFab2 in the B16 melanoma mouse model with syngeneic, immunocompetent mice. C57Bl/6 mice were inoculated 2500 EpCAM transfected B16 melanoma cells and treated with 6x20µg of the bsFab2. While all of six treated mice survived without developing a tumor, in the control group five of six mice died within 10 weeks. No significant side effects were observed. Our data demonstrate that the TNF activity of the EpCAM X TNFR1-bsFab2 is strictly depending on the presence of EpCAM positive tumor cells, stimulates cellular inflammatory responses in immediate vicinity of target antigen expressing tumors and provide the rationale for further studies evaluating the clinical potential of selective TNFR activation with bispecific antibodies in humans.