Evaluierung eines quantitativen PCR-Nachweisverfahrens zur Bestimmung der Expression von Zytokin-und Chemokingenen

Abstract

Der quantitative Nachweis von Zytokin-/Chemokin-Produktion unter pathophysiologischen Bedingungen ermöglicht die Gewissheit von ablaufenden immunologischen Prozessen im Körper eines Patienten. Aufgrund dessen wird dabei die verhältnismäßig moderne Technologie der Real-time RT-PCR, angesichts ihrer simplen Durchführbarkeit, hohen Spezifität, Sensitivität und Reproduzierbarkeit verstärkt angewendet, um die vorliegende Zytokin- /Chemokin-Genexpression quantifizieren zu können. In der vorliegenden Studie wurde mittels LightCycler-Gerät unter der Verwendung eines einheitlichen Reaktionsansatzes und eines konstanten PCR-Protokolls ein Real-time-Assay zur absoluten Quantifizierung der mRNA-Expression für die nachstehende Auswahl an Zytokinen und Chemokinen sowie einen Tanskriptionsfaktor etabliert: IL-1a, IL-1ß, IL-2, IL-6, MIP-3a, SCYB-11, ICAM-1 und NF B. Um die absolute Quantifizierung zu gewährleisten, wurden für jedes einzelne Zytokin / Chemokin ein externer Standard generiert, und mittles Einsatz der Standards in den LightCycler evaluiert. Die hochspezifische PCR-Detektion war durch die Verwendung von Hybridisierungs-Sonden gesichert. Im direkten Vergleich zu anderen Real-time PCR-Assays, hat sich eine vergleichbare Reproduzierbarkeit und eine hohe Sensitivität für die einzelnen Zyto-und Chemokine erwiesen (Detektionslimit: 101 Kopien für: IL-2, IL-6, MIP3- , NF B und ICAM-1 Standard, 102 Kopien für IL-1 und IL-1 Standard und 103 Kopien beim SCYB-11-Standard). Die vorliegende Methode lässt ein effizientes System zur Anfertigung von Zyto- und Chemokin-Profilen erkennen, vor allem wegen seines hohen Durchsatz (25 Proben/ = 60 min) sowie dem Einsatz eines ausgedehnten Spektrums an Zyto-und Chemokinen. Diese Studie zeigt, dass der dargestellte Assay eine sehr leistungsfähige Methode ist um die quantitative Zytokin-/Chemokin-Expression zu analysieren.

Cytokines and chemokines are key mediators of immunity and inflammation. Detection of cytokines and chemokines in pathophysiological states provides useful diagnostic tools for investigating host responses to invading organism,trauma, and tumors. Real-time PCR assays have become an important factor for quantifying the number of cytokine/chemokine gene expression in different settings and clinical materials.These assays offer a rapid, standarized, sensitive, reproducible and accurate method that combines rapid in vitro amplification with real-time quantification of the cDNA or DNA load. In this study, a rapid, single, and easy to perform LightCycler RT-PCR assay for the quantification of 8 different mRNA expression of the following cytokines and chemokines: IL-1a, IL-1ß, IL-2, IL-6, MIP-3 a, SCYB-11, ICAM-1 and NF?B, was used. For all targets, specific primers,probes and external standards were established and evaluated. The lower detection limit of the assay ranged between 101 copies (e.g. IL-2 or IL-6) and 103 copies ( SCYB-11).A lower detection limit of 101 copies was achieved for 5 of the 8 targets. The reproducibility of the assay was also evaluated. The study shows that a simple assay was provided for a rapid ,standardized and efficient analysis of the expression of 8 immunorelevant genes.