Hochregulierung des Aktivierungsmarkers E-NPP3 (CD203c) auf der Oberfläche basophiler Granulozyten nach In-vitro-Stimulation mit definierten Bienen- und Wespengiftallergenen bei Insektengiftallergikern

Abstract

Einleitung: Der Einsatz definierter Einzelallergene anstelle von Allergenextrakten hat in der Diagnostik von IgE-Antikörper-vermittelten Soforttypallergien zunehmend an Bedeutung gewonnen. Die Gifte der Biene (Apis mellifera) und der Wespe (Vespula vulgaris) enthalten zahlreiche verschiedene Einzelkomponenten. Eine allergene Wirkung ist vor allem für die hochmolekularen Proteine der Insektengifte bekannt. Um die Sensibilisierung gegenüber definierten Bienen- und Wespengiftallergenen zu untersuchen, wurde in dieser Studie ein kürzlich beschriebener In-vitro-Allergietest verwendet und weiterentwickelt. Er basiert auf der Allergen-induzierten Hochregulierung der CD203c-Expression auf basophilen Granulozyten.

Patienten und Methoden: Vollblutproben von 41 Patienten mit Verdacht auf Bienen- und/ oder Wespengiftallergie sowie von 9 Kontrollpersonen wurden mit den gereinigten Bienengiftallergenen Phospholipase A2 (Api m1), Hyaluronidase (Api m2) und Melittin (Api m4) oder den gereinigten Wespengiftallergenen Phospholipase A1 (Ves v1), Hyaluronidase (Ves v2) und rekombinantem Antigen 5 (Ves v5) stimuliert. Zusätzlich wurden zwei gereinigte Allergene der Papierwespe sowie herkömmliches Bienen- und Wespengiftextrakt eingesetzt. PBS diente als Negativ-, Anti-IgE-Antikörper als Positivkontrolle. Die CD203c-Expression der basophilen Granulozyten wurde mit Hilfe des fluorochrommarkierten, CD203c-spezifischen Antikörpers 97A6-PE durchflusszytometrisch analysiert. Die Ergebnisse des In-vitro-Allergietests wurden mit jenen der Standarddiagnostik (Evaluation der Anamnese, Bestimmung spezifischer IgE-Antikörper, Intrakutantests) verglichen. Zusätzlich wurden die Basophilen zweier wespengiftallergischer Nonresponder, vor Allergenstimulation in Interleukin-3-haltigem Medium kultiviert und anschließend auf ihre CD203c-Expression untersucht. Als Kontrollen dienten ein wespengift-allergischer Responder und zwei nichtallergische Kontrollpersonen.

Ergebnisse: Mit Hilfe des modifizierten In-vitro-Allergietest ließ sich für 37/41 Patienten die Diagnose der Standardverfahren bestätigen. Unter den Wespengiftallergikern fanden sich 4 Nonresponder, deren Basophile nach Stimulation mit Allergen/ Anti-IgE-Antikörper nicht in der Lage waren, CD203c hochzuregulieren. Durch Verwendung definierter Allergenmoleküle war es möglich, für jeden untersuchten Patienten das individuelle Muster der Sensibilisierung auf einzelne Giftbestandteile zu bestimmen. 28 der 36 untersuchten Patienten mit einer Wespengiftallergie zeigten eine Hochregulierung von CD203c auf Ves v5, 26 dieser Patienten reagierten mit Ves v2, 23 mit Ves v1. Unter den 14 Patienten mit Bienengiftallergie traten 9 positive Reaktionen auf Api m1 und 14 auf Api m2 auf. Keiner dieser Patienten reagierte auf Api m4. Für 3 Bienengiftallergiker und 3 Wespengiftallergiker zeigten sich kreuzreagierende IgE-Antikörper gegen die homologen Hyaluronidasen beider Insektengifte, die unter Einsatz der Insektengiftextrakte verborgen geblieben waren. Kreuzreaktionen traten auch bei einigen wespengiftallergischen Patienten für die Phospholipasen und Hyaluronidasen der Wespe und der Papierwespe auf. Eine mit Hilfe der Standarddiagnostik gestellte Wespengiftallergie konnte bei zwei Nonrespondern im In-vitro-Test nachvollzogen werden, nachdem ihre Basophilen zuvor mit Interleukin-3 behandelt worden waren. Sie hatten vor Inkubation mit IL-3 keine Wespengift-induzierte Hochregulation der CD203c-Expression gezeigt.

Diskussion: Die durchflusszytometrische Bestimmung der Allergen-induzierten Hochregulierung der CD203c-Expression auf basophilen Granulozyten stellt einen einfachen, schnellen und wenig invasiven In-vitro-Allergietest dar. Mit Hilfe definierter Allergenmoleküle ist es möglich, für jeden untersuchten Patienten das individuelle Sensibilisierungmuster gegen einzelne Giftbestandteile zu ermitteln. Für Nonresponder-Individuen scheint die vorherige Kultivierung der Basophilen in IL-3-haltigem Medium eine Möglichkeit darzustellen, die spezifische Hochregulierbarkeit von CD203c wiederherzustellen. Mit Hilfe dieses Verfahrens können auch Nonresponder-Patienten dem CD203c-Test zugänglich gemacht werden.

Introduction: Bee and wasp venom contain potent allergens capable of inducing severe clinical reactions. To analyze immediate-type hypersensitivity to defined hymenoptera venom components, a recently developed in vitro test was applied. This test is based on the allergen-induced upregulation of the activation marker CD203c on human blood basophils.

Methods: CD203c expression on blood basophils of 9 healthy donors and 41 patients allergic to bee and/or wasp venom was analyzed by flow cytometry before and after activation with the purified bee venom allergens phospholipase A2 (Api m1), hyaluronidase (Api m2) and melittin (Api m4), or the purified wasp venom allergens phospholipase A1 (Ves v1), hyaluronidase (Ves v2) and the recombinant antigen 5 (Ves v5). Additionally two paper wasp allergens as well as the crude bee and wasp venom extracts were applied. Venom-induced CD203c upregulation was compared with patients’ allergy history, skin tests and assessment of venom specific IgE antibodies. Basophils of nonresponders were preincubated with 10 ng/ml interleukin-3 (IL-3) prior to allergen stimulation.

Results: CD203c upregulation on basophils was induced specifically by hymenoptera venom components in 37/41 patients with a diagnosed allergy to bee and/or wasp venom. Twenty-eight of the 36 tested patients with wasp venom allergy showed CD203c upregulation in response to Ves v5, 26 of these patients also reacted with Ves v2 and 23 with Ves v1. Nine of 14 patients with bee venom allergy reacted with Api m1, 14 individuals with Api m2 and none of these patients with the minor allergen Api m4. Using defined venom components cross-reactions against the homologous bee and wasp venom hyaluronidases could be identified in several patients. Within the wasp venom allergic individuals we identified 4 nonresponders whose basophils did not show CD203c upregulation upon stimulation with allergen/anti IgE antibody. After pretreatment with IL-3, basophils of 2 nonresponders specifically upregulated CD203c in response to wasp venom.

Conclusions: Flow cytometric determination of CD203c upregulation on blood basophils activated by molecularly defined allergens is a powerful method to identify the precise allergen reactivity in sensitized individuals. In case of nonresponder individuals preincubation of basophils with IL-3 seems to be a possibility to restore specific upregulation of CD203c. By this means the CD203c-test could also be used for nonresponders.