Molekulare Mechanismen einer Yersinia enterocolitica induzierten Wirtszellaktivierung

Abstract

In dieser Studie konnte dem multifunktionellen Virulenzfaktor YadA, der Adhäsion, Serumresistenz und Autoagglutination vermittelt, eine weitere Eigenschaft hinzugefügt werden. YadA induziert, wie auch der Virulenzfaktor Invasin (Inv), der die Internalisierung von Yersinia über Bindung an beta1-Integrine vermittelt, beta-1 Integrin abhängig die Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-8 in Epithelzellen. Die vergleichende Analyse der Inv- und YadA- vermittelten IL-8 Sekretion zeigte, dass die Signalkaskaden durch ähnliche oder sogar identische Moleküle vermittelt werden. Inhibitorstudien zeigten, dass sowohl für Inv, als auch YadA, GTPasen der Rho Familie und MAPkinasen wie p38, MEK1 und JNK an der Signaltransduktion beteiligt sind. Ebenso ist die IL-8 Sekretion in beiden Fällen beta1-Integrin vermittelt. Diese Studie zeigt, YadA, neben Inv, YopB und Yersinia Lipopolysaccharid als einen weiterern Induktor von proininflammatorischen Molekülen, mit welchem Yersinien eine inflammatorische Gewebsreaktion auslösen können. Weitere in vivo Untersuchungen sollen zeigen, welche Bedeutung die proinflammatorischen Eigenschaften von YadA für den Infektionsverlauf haben. Für die Induktion einer proinflammatorischen Reaktion über beta1-Integrine, ist die Vernetzung der beta-1 Integrine notwendig. Dies wird nur erreicht, wenn sie Stimulation durch Inv, welches auf Bakterien exprimiert wird oder an Latex-Partikel gebunden ist, erfolgt. Untersuchungen mit integrindefizienten Fibroblasten ergaben, dass auch lösliches Inv eine proinflammatorische Antwort auslösen kann. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass Inv auch beta1-Integrin unabhängig, eine proinflammatorische Antwort über einen anderen Rezeptor auslösten könnte. Initiale Untersuchungen ergaben, dass Inv möglicherweise über Toll-like Rezeptor 2 eine proinflammatorische Antwort induziert. In vitro Untersuchungen, mit Milzzellen und dendritischen Zellen aus TLR-2 und TLR-4 defizienten Mausstämmen unterstützen diese Hypothese. Da das rekombinante Inv Protein nicht LPS frei zur Verfügung stand und weitere Kontaminationen nicht ausgeschlossen werden konnten, war es nicht möglich abschließend zu klären, ob es sich bei der möglichen Inv-TLR2 Interaktion, um einen Artefakt oder eine reelle Beobachtung handelt. In der homologen Membranankerdomäne von Proteinen, der Oca Familie, zu der YadA gehört ist eine hochkonservierte Aminosäure, bei YadA von Y. enterocolitica an Position 389 zu finden. Um zu untersuchen, ob die diese Aminosäure für den Autotransport des Proteins in die äußere Membran und funktionell von Bedeutung sind, wurden die Mutanten YadA G389A, YadA G389S, YadA G389H und YadA G389H hergestellt. Während das Wildtyp YadA in Western Blot-Analysen primär in seiner trimeren Form nachweisbar war, konnte YadA G389A und YadA G389S nur noch in seiner monomeren Form nachgewiesen werden. Deshalb ist anzunehmen, dass aufgrund einer Konformationsänderung die Stabilität des Proteins verändert ist. Auf die YadA vermittelte IL-8 Sekretion haben die Mutationen keinen Einfluss. Eine Proteinexpression der vollständig sequenzierten Mutanten YadA G389H und YadA G389T konnte nicht nachgewiesen werden. In weiteren Untersuchungen muss der Zusammenhang zwischen diesen Punktmutationen und der aberranten Proteinexpression geklärt werden. Ebenso soll untersucht werden, wie sich die Mutationen G389A und G389S bei einer Infektion in vivo auswirken.

The major invasive factor of Yersinia enterocolitica, the invasin (Inv) protein, induces proinflammatory host cell responses, including interleukin-8 (IL-8) secretion from human epithelial cells, by engagement of beta1 integrins. The Inv-triggered beta1 integrin signaling involves the small GTPase Rac; the activation of MAP kinases, such as p38, MEK1, and JNK; and the activation of the transcription factor NF-kappaB. In the present study, we demonstrate that Y. enterocolitica YadA, which is a major adhesin of Y. enterocolitica with pleiotropic virulence effects, induces IL-8 secretion in epithelial cells. The abilities of YadA and Inv to promote adhesion to and invasion of HeLa cells and to induce IL-8 production by the cells were investigated by expression of YadA and Inv in Escherichia coli. While YadA mediates efficacious adhesion to HeLa cells, it mediates marginal invasion compared with Inv. Both YadA and Inv trigger comparable levels of IL-8 production. Conformational changes of the YadA head domain by mutation of NSVAIG-S motifs, which abolish collagen binding, also abolish adhesion of Yersinia to HeLa cells and YadA-mediated IL-8 secretion. Furthermore, experiments in which blocking antibodies against beta1 integrins were used demonstrate that beta1 integrins are crucial for YadA-mediated IL-8 secretion. Inhibitor studies demonstrate the involvement of small GTPases and MAP kinases, such as p38, MEK1, and JNK, indicating that beta1 integrin-dependent signaling mediated by Inv or YadA involves similar signaling pathways. These data present YadA, in addition to Inv, YopB, and Yersinia lipopolysaccharide, as a further inducer of proinflammatory molecules by which Y. enterocolitica might promote inflammatory tissue reactions.