Molekulare Charakterisierung von einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanälen (Kir) in reninsezernierenden Zellen in der afferenten Arteriole der Rattenniere

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die molekulare Identität und die Lokalisation von 2 Arten einwärtsgleichrichtender Kaliumkanäle (Kir) untersucht, zum einen die starken Gleichrichter, welche für das Ruhemembranpotential (ca. -60 mV) in reninsezernierenden juxtaglomerulären Zellen (JGZ) verantwortlich sind, zum anderen die metabolisch regulierten und pharmakologisch wichtigen vaskulären KATP-Kanäle. Um ein möglichst aussagekräftiges Expressionsprofil zu erstellen, wurden die Kir-Kanäle auf RNA- und Proteinebene untersucht. Die genaue Lokalisation des Proteins in den JGZ erfolgte durch immunhistochemische Färbungen an Kryoschnitten der Niere und wurde durch den Nachweis des Kanalproteins in der Niere mittels Western Blotting ergänzt. Der Nachweis der mRNA des jeweiligen Kanals erfolgte mittels semiquantitativer RT-PCR. Untersuchungen im Gehirn dienten als Positivkontrolle. Kir6.1, die Alpha-Untereinheit des vaskulären KATP-Kanals, konnte erstmals in JGZ der Rattenniere mittels Immunfluoreszenz dargestellt werden. Der Nachweis des Proteins konnte im Western Blot bestätigt werden. Immunhistologische Untersuchungen konnten die Lokalisation von Kir2.1, jedoch nicht von Kir2.2, in der Media der afferenten Arteriole zeigen. Der Proteinnachweis im Western Blot zeigt für Kir2.1 und Kir2.2 positive Bandenexpression in der Niere. In der RT-PCR konnte eine mRNA-Expression von Kir2.1 und Kir2.2 in den JGZ und der Niere nachgewiesen werden. Die nachgewiesene molekulare Identität der Kaliumkanäle zeigt, daß Kir2.1 und Kir2.2, die dem einwärtsgleichrichtenden Strom in JGZ zugrunde liegen könnten, dort auch vorkommen. Die Immunhistochemie und elektrophysiologische Untersuchungen weisen allerdings darauf hin, daß Kir2.1 die dominante oder alleinige Kanaluntereinheit ist (Leichtle A. et al., J Physiol 560: 365-376, 2004). Ein kleiner Anteil von Kir2.2 kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. Der Strom, der durch diese Kanäle getragen wird, spielt eine dominierende Rolle in der Aufrechterhaltung des Membranpotentials der JGZ und trägt über die Modulation der Reninsekretion zur Regulation des Blutdrucks bei.

In the assignment at hand the molecular identity and localisation of 2 inwardly rectifying Potassium channels (Kir) was investigated. One was the strong rectifier which is responsible for stabilising the membrane potential (ca. -60 mV) in renin secreting juxtaglomerular cells (JGC). The other were the metabolically regulated and pharmacologically important vascular KATP-channels. In order to achieve a significant expression profile the Kir channels were examined on the RNA and protein level. The exact localisation of the JGC was achieved through immunhistochemic staining of cryoslices of the kidney. This was complemented by the detection of the channel protein via western blot. The detection of the complementing mRNA of the specific channels was achieved via semiquantitative RT-PCR. Tests on Rat brain were used as positive controls. Kir 6.1, the alpha-subunit of the vascular KATP-channels, was detected for the first time in JGC of the rat kidney via immunofluorescence. The verification of the detection of the protein was achieved via Western blot. Immunohistological investigation could show the localisation of Kir2.1 but not of Kir2.2 in the Media of the afferent arteriole. The protein detection in the western blot showed positive results for expression of Kir2.1 and Kir2.2 in the kidney. In RT-PCR it was possible to prove the expression of mRNA of Kir2.1 and Kir2.2 in the JGC and the kidney. The detected molecular identity of the potassium channels shows that Kir2.1 and Kir2.2, which could be possible for the inwardly rectifying flow in JGC, are localised there. However, the immunohistochemical and electrophysiological investigations seem to indicate that Kir2.1 is the dominating or single potassium channel (Leichtle A. et al, J Physiol 560: 365-376, 2004). A small part may still be allotted to Kir2.2. The flow, which is supported by these channels, is playing a dominating role in the Maintenance of the membrane potential in JGC and contributes therefore via modulation of the renin secretion to the regulation of the blood pressure.