Untersuchungen zur Bedeutung von Arginin für die induzierte NO-Synthese im ZNS

Abstract

Die induzierbare NO-Synthase (iNOS) wird bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen verstärkt exprimiert und steht im Verdacht, an der Pathogenese dieser Erkrankungen beteiligt zu sein. Da Arginin der iNOS als Substrat dient, steht die induzierte NO-Produktion in engem Zusammenhang mit dem Argininstoffwechsel. In der vorliegenden Arbeit wurden in Modellsystemen für Microgliazellen (N11-Zellen) und für Astrocyten (C6-BU-1-Zellen) Aspekte der induzierten Produktion von NO und des Argininstoffwechsels unter dem Einfluss möglicher therapeutischer und endogener Modulatoren untersucht. Die NO-Produktion wurde mit den Immunstimulantien Lipopolysaccharid (LPS) und/oder Interferon-Gamma (IFN-Gamma) induziert. Mit Aspirin und TGF-Beta wurden zwei Substanzen eingesetzt, die die NO-Produktion hemmen. Mit CML als Modellsubstanz für sogenannte advanced glycation endproducts (AGEs), Reaktionsprodukte langlebiger Proteine mit Glucoseresten, wurde ein potentieller Induktor der NO-Produktion untersucht. Es wurde gezeigt, dass Aspirin die durch Immunstimulantien induzierte NO-Produktion hemmt. Bei der Untersuchung der Wirkung von Aspirin auf den Argininstoffwechsel zeigte sich, dass Aspirin auch die Induzierbarkeit von für die Argininversorgung der iNOS wesentlichen Enzymen und Transportern vermindert: In C6-BU-1-Zellen hemmte Aspirin die Induktion der Argininosuccinat-Synthethase (ASS) (auf Proteinebene), in N11-Zellen verminderte Aspirin die durch Immunstimulantien induzierte Hochregulation der Expression der Arginintransporter CAT-1 und CAT-2A (auf mRNA-Ebene). Eine Minderversorgung der iNOS mit Arginin könnte somit zur Inhibition der NO-Produktion durch Aspirin beitragen. Bei der Untersuchung von TGF-Beta zeigte sich dagegen ein anderes Bild. In N11-Zellen hat TGF-Beta keinen Effekt auf die NO-Produktion. In C6-BU-1-Zellen hemmt TGF-Beta die Induktion der NO-Produktion, die Induktion der Argininosuccinat-Synthetase (ASS) durch Immunstimulantien wird jedoch durch TGF-Beta verstärkt. Die Regulation der Argininversorgung der iNOS ist also unter physiologischen Bedingungen nicht einfach als Regulationsmechanismus der NO-Produktion zu verstehen, sondern hat möglicherweise weitere Funktionen. Beispielsweise produziert die NOS bei Argininmangel Superoxid, das mit auch in kleinsten Mengen vorhandenem NO zu stark cytotoxischem Peroxynitrit reagiert. TGF-Beta könnte also über die Induktion der ASS einem Argininmangel mit daraus resultierender Peroxynitritbildung vorbeugen. Es wurde desweiteren die Induktion des Argininosuccinatlyase-Proteins (ASL) untersucht. Die ASL wird im Allgemeinen als konstitutiv exprimiertes Enzym angesehen. Auch in unseren Experimenten hatte keine der untersuchten Substanzen einen Einfluss auf das Expressionsniveau des ASL-Proteins. Daher eignet sich die ASL für die Verwendung als interner Standard bei Proteinnachweisen z.B. im Western Blot. Bei der Untersuchung von CML zeigte sich dass in gemischten Glia-Primärkulturen und in N11-Zellen bei einem Teil der Experimente die durch IFN-Gamma induzierte NO-Produktion durch CML verstärkt wurde. Zur Beantwortung der Frage ob es sich hierbei um reproduzierbare Ergebnisse handelt, sind weitere Experimente notwendig.

The inducible nitric oxide-synthase (iNOS) is expressed in the CNS in various neurodegenerativ diseases and is suspected to contribute to their pathogenesis. The only physiological substrate of all isoforms of NO-synthase is arginine which participates in the regulation of NO-production. In this study we investigated in glial celllines (N11-cells, C6-BU-1-cells) several aspects of induced NO-production and argininemetabolism under the influence of potential therapeutic and endogenous modulators. NO-production was induced by the immunostimulants lipopolysaccharide (LPS) and/or interferon-Gamma (IFN-Gamma); the investigated substances were Aspirin, transforming-growth-factor-Beta (TGF-Beta) and carboxymethyllysine (CML) as a modelsubstance for advanced glycation endproducts (AGEs). Aspirin inhibited the immunostimulant-mediated induction of NO formation. In addition Aspirin reduced the induction of enzymes and transporters assuring the arginine supply of iNOS: In C6-BU-1-cells the induction of argininosuccinate synthase protein (ASS) was inhibited by Aspirin. In N11-cells the induction of the argininetransporters CAT-1 and CAT-2A was reduced by Aspirin (at the level of mRNA). Thus a restriction of arginine supply could contribute to the inhibiton of NO formation by Aspirin. These findings are in contrast to the results of our experiments with TGF-Beta. In C6-BU-1-cells TGF-Beta inhibited the induction of NO formation by immunostimulants while the induction of ASS protein was enhanced. Thus regulation of the substrate supply of iNOS has possibly further physiological functions. At low concentrations of arginine NOS generates superoxide which forms with even traces of NO the highly toxic radical peroxynitrite. Thus TGF-Beta could prevent arginine depletion with resulting peroxynitrite formation by induction of ASS. Furthermore the induction of argininosuccinate lyase protein (ASL) was investigated. Following former reports ASL appears to be a constitutive enzyme. This was confirmed in our experiments where none of the investigated substances did affect ASL expression. Therefore ASL can be used as an internal standard in protein assays such as western blot. In part of our experiments with CML, NO formation induced by IFN-Gamma was further enhanced by CML in mixed glial cellcultures and N11-cells. To assure this finding further investigations are necessary.