Wirkungen des Pancaspase-Inhibitors zVAD-FMK auf die Apoptose von Makrophagen und Lymphozyten

Abstract

Grundlagen: Die intrazelluläre Aktivierung von Caspasen ist ein Schlüsselereignis der Apoptose. zVAD-FMK ist ein in der Forschung häufig als Apoptosehemmstoff verwendeter Pancaspase-Inhibitor, der u.a. dazu genutzt wurde, die T-Zellapoptose zu blockieren. Verhalten und Überleben der T-Zellen werden maßgeblich von antigenpräsentierenden Zellen, insbesondere den Makrophagen beeinflusst. Ziel: Die Wirkung von zVAD-FMK auf das Apoptoseverhalten der Makrophagen sollte untersucht werden. Dabei wurde die Hypothese geprüft, ob zVAD-FMK durch Apoptose von Makrophagen die T-Zellantwort beeinflusst. Zusätzlich sollten Unterschiede im Apoptoseverhalten zwischen Zellen von Neugeborenen und Erwachsenen aufgedeckt werden. Material und Methoden: Aus Nabelschnurblut (NSB) und peripherem Blut von gesunden Erwachsenen (PB) wurden mononukleäre Zellen isoliert, mit zVAD-FMK inkubiert und mit dem T-Zellmitogen OKT3, einem monoklonalen Antikörper gegen CD4 (ch412), Lipopolysaccharid (LPS) sowie Kombinationen aus Lipopolysaccharid (LPS) und Interferon-gamma (IFNgamma) stimuliert. Die Apoptoserate wurde durchflusszytometrisch mit Annexin V und Propidiumiodid bestimmt. Parallel wurde der Phänotyp von Makrophagen und T-Zellen analysiert. Ergebnisse: zVAD-FMK führte spezifisch zur Abnahme der Makrophagenzahl um 50% (p < 0.05). Verbleibende Makrophagen erschienen mit verminderter Zellgröße und erhöhter Granularität. Der 'Schrumpfungszelltod' wurde durch die signifikant erhöhte Anfärbung mit Annexin V und Propidiumiodid als Apoptose bestätigt. Kinetiken ergaben, dass die Hälfte der Makrophagen innerhalb von 24 Stunden unter gleichzeitiger Herabregulation von CD14 um 80% apoptotisch wurden. Makrophagen aus NSB und PB unterschieden sich nicht in ihrer Reaktion auf zVAD-FMK. Die Expression von B7-Molekülen und HLA-DR blieben unverändert, während die Expression von MHC Klasse I-Molekülen und der Anteil CD16 exprimierender Makrophagen durch die Caspase-Inhibition abnahm. Phänotyp und Überleben der Lymphozyten (T-, B-, NK-Zellen) blieben dagegen unbeeinträchtigt. CD95 und CD95Ligand wurden durch zVAD-FMK weder auf Makrophagen noch Lymphozyten reguliert. Aktivierung der Makrophagen mit Lipopolysaccharid konnte ihre Apoptose nicht verhindern. Ihr Zelltod durch OKT3 wurde verstärkt, während die OKT3-bedingte T-Zelldeletion durch zVAD-FMK vollständig verhindert wurde. T-Zellproliferation und die Aufregulation von CD28 durch OKT3 wurden gehemmt. Die Apoptose der CD4-T-Zellen durch ch412 konnte mit zVAD-FMK um 50% reduziert werden bei gleichzeitiger Abnahme der Makrophagenzahl. Schlussfolgerung: zVAD-FMK induzierte Apoptose in Makrophagen und beeinflusste dadurch makrophagenvermittelte T-Zellreaktionen. Ob diese Wirkung durch die Caspasehemmung selbst oder durch Interaktion mit anderen Molekülen verursacht wurde, bleibt zu untersuchen.

Background: The intracellular activation of caspases is a key event in apoptosis. zVAD-FMK is an inhibitor of the caspase family often used in research to block e.g. T cell apoptosis. T cell reactions and -survival are orchestrated by antigen presenting cells such as macrophages. Aim: To investigate the effect of zVAD-FMK on macrophages and to test the hypothesis, whether it influences T cell reactions via macrophage apoptosis. In addition to discover differences between apoptosis of neonatal and adult cells. Material and methods: Mononuclear cells were isolated from cord blood (CB) and peripheral blood of healthy adults (PB), cultured with zVAD-FMK and stimulated with the T cell mitogen OKT3, a monoclonal CD4-antibody (ch412), lipopolysaccharide (LPS) or combinations of lipopolysaccharide (LPS) and Interferon-gamma (IFNgamma). Apoptosis was measured by flow cytometry using Annexin V and propidium iodide. Further on phenotypic analysis of macrophages and lymphocytes was performed. Results: zVAD-FMK led to a specific decrease of 50% in macrophage count (p < 0.05). Remaining macrophages appeared with reduced size and increased granularity indicating 'schrinking death', which was confirmed as apoptosis by a significantly increased uptake of Annexin V and propidium iodide. Kinetics revealed apoptosis of half the macrophages within 24 hours accompanied by a downregulation of CD14 macrophage-receptors to 20%. Macrophages in CB and PB did not differ in their sensitivity towards zVAD-FMK. B7- and HLA DR-expression was unaffected by caspase inhibition, whereas MHC class I-expression and the number of CD16-expressing macrophages decreased. Lymphocyte phenotype and survival (T-, B-, NK-cells) remained unaffected. CD95- and CD95L-expression was not changed by zVAD-FMK neither on macrophages nor on lymphocytes. LPS-activation did not prevent zVAD-FMK-induced macrophage apoptosis. zVAD-FMK increased OKT3-mediated macrophage death, whereas OKT3-mediated T cell deletion was completely prevented. OKT3-induced T cell proliferation and upregulation of CD28 were inhibited. zVAD-FMK reduced ch412-induced CD4-T cell apoptosis by 50% accompanied simultaneously by a decrease in macrophage count. Conclusion: zVAD-FMK initiated macrophage apoptosis thereby affecting macrophage-mediated T cell reactions. Whether this effect is induced by caspase inhibition itself or by interaction with cellular molecules remains to be investigated.