rRNA Regulationsmechanismen bei Staphylococcus aureus in vitro et in vivo

Abstract

Ziel dieser Dissertation war es, die metabolische Aktivität von S. aureus in vitro und in vivo zu untersuchen. Die Methoden wurde in vitro etabliert und dann auch in vivo durchgeführt. Durch Isolierung von RNA während verschiedener Wachstumsphasen wurde die Menge an RNA pro Zelle in vitro bestimmt. Die Messung der RNA erfolgte durch photometrische Messungen, Gel-Elektrophorese, Slotblot und FISH. Parallel dazu wurde eine photometrische Bestimmung des DNA-Gehaltes durchgeführt. Anschließend wurde die etablierte FISH Methode zur Bestimmung der metabolischen Aktivität der S. aureus Bakterien in vivo angewendet. Dies geschah zum einem mit Sputumproben von CF-Patienten mit einer chronischen S. aureus Lungeninfektion und zum anderen mit Exsudaten im Tiermodell. Meerschweinchen wurden dabei nach 1, 2, 4, 6 und 8 Tagen Exsudat aus einer Fremdkörperinfektion mit S. aureus abgezogen. Es konnte in vitro gezeigt werden, dass mit dem Eintritt der Bakterien in die späte postexponentielle Phase t3 der RNA Gehalt um mehr als 50% abnimmt. Der Gehalt an DNA hingegen nahm nur um etwa 25% ab. In vivo konnte mittels PNA FISH gezeigt werden, dass sich die S. aureus Bakterien in Sputa in verschiedenen Wachstumsphasen befanden. Es gab nicht nur Unterschiede zwischen den Sputa der verschiedenen Patienten sondern sogar innerhalb der Sputaproben selbst. Meist lag ein schwächeres Signal im Vergleich zu den in vitro durchgeführten Versuchen vor, was auf eine reduzierte Stoffwechselaktivität in vivo schließen lässt. Die Exsudate zeigten bei der FISH während des zeitlichen Verlaufs der Infektion eine Abnahme in der Intensität, was ebenfalls auf eine reduzierte Stoffwechselaktivität schließen lässt. Die vorliegende Dissertation bildet die Grundlage für weitere Untersuchungen in vivo wie beispielsweise die Klärung der unterschiedlichen Aktivität der S. aureus Bakterien in Sputa. Auch könnte die Verwendung von Antibiotika während der Fremdkörperinfektion im zeitlichen Verlauf untersucht werden.

Aim of this dissertation was to investigate the metabolic activity of S. aureus in vitro and in vivo. The methods were established in vitro and then also carried out in vivo. The amount of RNA per cell was determined in vitro by isolating RNA during different states of growth. The measuring of RNA was done by using photometric measurings, gel-electrophoresis, slotblot and FISH. In addition to this a photometric determination of the amount of DNA was performed.

Afterwards the established FISH method was used to determine the metabolic activity of S. aureus in vivo. On the one hand this was done by using sputa samples of CF-patients with a chronicle S. aureus pneumonia and on the other hand by using exudates from animals. Therefore exudates from cavies with an S. aureus impurity infection were extracted after 1,2,4,6 and 8 days.

It could be shown in vitro that with bacterial entering into the post exponential phase t3 the amount of RNA declined by more than 50% whereas the amount of DNA declined only about 25%.

In vivo could be shown with PNA FISH that S. aureus bacteria in sputa are arranged in different growth stadiums. There were not only discrepancies between the different sputa of different patients but also between the same samples. Mostly the signal strength was diminished compared to the signal strength of the in vitro assays. This leads to the conclusion of a reduced metabolic activity in vivo. The FISH of the exudates showed during the course of time of the infection a decrease concerning the signal strength, what also leads to the conclusion of a reduced metabolic activity.

This dissertation generates the basis for further studies in vivo like for example the purification of different metabolic activity of S. aureus bacteria in sputa. The application of antibiotics during impurity infection could be analyzed as well.