Über die Wirkung von Meclofenaminsäure, 90Yttrium und deren Kombination auf humane aortale glatte Muskelzellen in einem in-vitro Modell der vaskulären Rezidivstenose

Abstract

Einleitung: Die in 25-60% der Fälle auftretenden arteriellen Rezidivstenosen in einem Zeitraum von 3 bis 6 Monaten nach Einsatz katheterinterventioneller rekanalisierender Verfahren schmälern nach wie vor die Langzeiterfolge dieser Therapie. Bisher hat noch kein Verfahren endgültig in die klinische Routine Einzug gefunden. In einem in-vitro Modell wird die Wirkung des Anthranilsäurederivats Meclofenaminsäure (=MFS) (in Konzentrationen bis 200µM) und des beta-Emitters 90Yttrium (in Dosen bis 8Gy in 4 Tagen) unter Zellkulturbedingungen auf proliferierende glatte humane aortale Muskelzellen (haSMCs) untersucht, einer Zellart, die in der Pathogenese der Restenose eine vorherrschende Rolle einnimmt. Zielsetzung: Das in-vitro Modell soll einerseits die Situation nach Implantation eines radioaktiven Stents niedriger Aktivität nachahmen, zum anderen die Etablierung einer postinterventionellen Pharmakotherapie in Langzeit-Behandlung sowie die Möglichkeit einer Kombination aus Radio- und Pharmakotherapie untersuchen. Methoden: Proliferationskinetik (PK): In Zellkulturflaschen werden die Zellen in einer Dichte von 1200/cm² ausgesät, mit MFS (25, 50, 100 und 200µM), 90Y (2, 4 und 8Gy) oder einer Kombination (50-200µM, 2-8Gy) behandelt und die Zellzahl in viertägigen Abständen bestimmt. Koloniebildungs-Assay (Kobi): An den Versuchstagen 4, 12 und 20 werden Kobis auf 6-well Platten mit je 500 Zellen in 2ml angesetzt und für 10 Tage inkubiert. Die untersuchten Konzentrationen bzw. Dosen entsprechen denjenigen der Proliferationskinetik. Migrations-Assay: An Tag 4 werden die Migrationsversuche durch Porenmembranen (8µm Porendurchmesser) für 2, 4 und 8Gy, für 0 und 200µM MFS, deren Kombinationen sowie unter Einsatz von PDGF durchgeführt. Durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse (FACS): An den Tagen 4, 12 und 20 werden für die MFS-Konzentrationen von 0, 50, 100 und 200µM, für die Dosen von 0, 4 und 8Gy sowie deren Kombinationen Zellzyklusanalysen durchgeführt. Um eventuelle mikroskopische Veränderungen des Cytoskeletts zu identifizieren, werden behandelte haSMCs immunfluoreszenztechnisch mit Antikörpern gegen α-Aktin und Vimentin gefärbt. Ergebnisse: MFS und 90Yttrium hemmen die Zellvermehrung in der Proliferationskinetik als auch bei den Kobis konzentrations- und dosisabhängig. Der Einsatz des Medikaments senkt die Plateauzellzahlen im Sinne einer Proliferationshemmung, das Radionuklid wirkt sich eher im Sinne einer Wachstumsverzögerung auf die SMCs aus. Langzeitexposition mit MFS führt zu einer Verminderung der Kobi-Zahlen im Beobachtungszeitraum, die Bestrahlung führt nach initialer Hemmung zu erneuter steigender klonogener Aktivität. 200µM MFS supprimiert das Wachstum in der PK und die Koloniebildung völlig, 8Gy 90Yttrium senkt die Zellzahlen an Tag 20 auf 12% der Kontrolle, die klonogene Aktivität der mit 8Gy bestrahlten Zellen beträgt an Tag 20 11,2% der maximalen Kobi-Rate. Das Proliferationsverhalten bei Kombinationstherapien ist uneinheitlich, Synergie ergibt sich lediglich für die 4Gy+50µM-Gruppe, in den Kobis wird bei der Kombinationstherapie die Erholungstendenz nach Bestrahlung abgeschwächt, sodass sie bei der 4Gy+100µM-Gruppe an Tag 20 erlischt. Der Einsatz von PDGF verdoppelt die Zellzahlen bei den Migrationsversuchen. 200µM MFS und die 8Gy-Gruppe hemmen in den Versuchen ohne Einsatz von PDGF das Migrationsverhalten signifikant. Für die höchst dosierten Kombinationstherapien kann von einer Suppression des Migrationsvermögens ausgegangen werden. Gegen Ende des Beobachtungszeitraums ist die Fraktion der mit 200µM MFS behandelten Zellen, die sich in der G2/M-Phase befindet, fast 2,5 mal so groß wie in der Kontrolle. Auch die 8Gy-Gruppe unterscheidet sich darin an den Tagen 12 und 20 signifikant von der Kontrolle. Morphologisch erscheinen im Gegensatz zu den MFS-behandelten Zellen die maximal bestrahlten Gruppen unter Immunfluoreszenz-Färbung zerfranster. Schlussfolgerungen: Meclofenaminsäure und 90-Yttrium inhibieren das Wachstums- und Migrationsverhalten von humanen aortalen glatten Muskelzellen konzentrations- und dosisabhängig, sodass deren Kombination Möglichkeiten bieten könnte in entsprechenden Verhältnissen ein optimales Wirkungsprofil bei minimierten Nebenwirkungen zu erstellen. Zur systemischen Einzeltherapie scheint MFS wegen der benötigten Konzentrationen und der zu erwartenden Nebenwirkungen ungeeignet; ein Einsatz im Rahmen lokaler Medikamentenapplikationen scheint prüfenswert. Der Einsatz von 90Yttrium bis 8Gy hemmt das Wachstum der glatten Muskelzellen in den ersten drei Wochen nach Bestrahlung sehr effektiv, der Einfluss der beobachteten Erholungseffekte der Zellvermehrung auf ein Stenoserezidiv muss in Langzeituntersuchungen exploriert werden.

Introduction: The incidence of arterial restenosis in 25% to 60% following percutaneous transluminal angioplasty after 3-6 month is still reducing the long-term efficiency of this therapy. Despite of a number of encouraging clinical studies investigating endovascular brachytherapy or drug-eluting stents, no method to reduce arterial restenosis has been proven to be clinically effective and practicable. The experiments are investigating the impact of meclofenamic acid (=MFA) and the beta-radiation of 90Yttrium on a cell culture of human aortic smooth muscle cells (haSMCs) during an observation period of 20 days. HaSMCs are known to play an essential role in the pathogenesis of arterial restenosis.

Aims: This in-vitro model is supposed to simulate the implantation of a low-activity radioactive stent, the establishment of a long-term postinterventional drug therapy as well as the option of a combined delivery of MFA and beta-radiation.

Methods: Growth kinetics (GK): Cell-culture flasks are planted with haSMCs (density: 1200 cells/cm²), treated with either MFA (25, 50, 100 und 200µM), 90Y (2, 4 und 8Gy) or a combination of both (50-200µM, 2-8Gy) and followed by cell counting every four days. Colony-forming assays (CFA): On days 4, 12 and 20 CFAs are assessed using 6-well-plates each of which are containing 500 cells dispersed in 2mL culture medium. The investigated doses and concentrations comply with those used in the GKs. Migratory ability assay: The migratory behaviour is investigated by stimulation with platelet derived growth factor (PDGF) in 24-well plates with 8µm pores membrane inserts. The cells are exposed to radiation doses of 2, 4 und 8Gy, to MFA concentrations of 0 und 200µM and to their combinations. Cell cycle analysis: On the day 4, 12 and 20 of the observation period cell cycle analysis is performed by flow cytometry (FACS) using 0, 50, 100 and 200µM MFA, 90Y doses of 0, 4, and 8Gy (and combination) for the treatment of the haSMCs. Cell immuno-staining: drug- and/or radiation-treated cells were stained by immuno-fluorescence technique with antibodies against alpha-actin and vimentin in order to identify morphological cytoskeletal changes.

Results: Treatments with MFA and/or 90Y show an inhibiting effect on the cell proliferation in the growth kinetics as well as on the CFAs in a dose- and concentration dependent manner. The application of MFA reduces the maximum level in terms of inhibition of proliferation, whereas exposure to the radionuclide influences the cell number`s rising kinetics in terms of growth delay. During the observation period long-term exposition by MFA diminishes the number of CFA compared to controlls, the radiation treatment leads to a sencondary increase of clonogenic activity after initial inhibition. 200µM MFA totally suppresses the proliferation in the growth kinetics and the CFA, 8Gy of 90Y drops the cellnumbers to 12% compared to controls, the clonogenic activity of the same subgroup reaches 11,2% of the maximum CFA rate on day 20. Regarding the combination therapies the response of cell growth is complex and inconsistent, synergistic effects can only be observed in the 4Gy+50µM treated group. The use of the combination therapy attenuates the recovery process of the radiated cells in the colony forming assays, so that the ability to form colonies is terminated in the 4Gy+100µM group on day 20. Supplementing PDGF dublicates the number of cells that pass the porous membrane. Application of 200µM MFS or 8Gy of 90Y inhibits the migratory ability of haSMCs in the subgroup without addition of PDGF in a statistically significant manner. Their combination leads to a supression of cell migration. On day 20 of the observation period, 2.5 times as many cells of the 200µM MFA treated subgroup are arrested in the G2/M-Phase compared to controlls. The 8Gy subgroup also shows a significant delay in the G2/M-Phase of the cell-cycle. In contrast to the MFA exposed cells, the maximal radiated group shows a slightly frayed appearance under the microscope after immunofluorescence staining.

Conclusions: MFA and the radiation of 90Y are inhibiting the growth and migratory behaviour of haSMCs in a concentration and dose dependent manner, so that their combination could provide positive impacts and, at the same time, minimal side effects. A systemic monotherapy of MFA seems to be unsiutable because of the required concentrations and the expected side effects, but the application in a way of “local-drug-delivery” seems to be reconsiderable. 8Gy of 90Y is inhibiting the growth of smooth muscle cells very effectively during the first 3 weeks after radiation. The influence of the recovery effects of cell growth in culture on the development of arterial restenosis requires further investigation.