Charakterisierung der Interaktion von DRA (down regulated in adenoma) mit E3KARP und NHERF

Abstract

Einleitung: DRA (down regulated in adenoma) ist ein apikaler intestinaler Anionen-Austauscher (Cl-/HCO3-), dessen Funktionsverlust zur kongenitalen Chlorid-Diarrhoe führt, einer in Teilen Finnlands endemisch vorkommenden Erbkrankheit. DRA vermittelt zusammen mit dem Na+/H+-Austauscher NHE3 die elektroneutrale NaCl-Resorption im Ileum und Colon. Für NHE3 wurde gezeigt, dass es mit seinem C-Terminus an die 2. PDZ (PSD 95, Disk Large, ZO-1) Domäne der Adapterproteine E3KARP (NHE3 Kinase A Regulatory Protein) und NHERF (NHE3 Regulatory Factor) bindet. Diese Interaktion ist entscheidend für die cAMP vermittelte Inhibition und apikale Lokalisation von NHE3. Die vier C-terminalen Aminosäuren von DRA, Glutamat - Threonin - Lysin - Phenylalanin (ETKF), ähneln einem PDZ-Interaktionsmotiv. Aufgrund der bereits bekannten funktionellen Kopplung von DRA und NHE3 liegt es nahe, dass DRA über sein PDZ-Interaktionsmotiv ebenfalls an eine der PDZ-Domänen von E3KARP und/oder NHERF bindet, und so zusätzlich eine strukturelle Kopplung entsteht.

Ziel der Dissertation: Untersuchung, ob und mit welcher Affinität DRA an die PDZ-Domänen von E3KARP und NHERF bindet.

Methodik: (1) Expression der verschiedenen Domänen ('full length', 1. PDZ, 2. PDZ, C-Terminus) von E3KARP und NHERF als His-Tag-Fusionsproteine und Testung, ob diese den C-Terminus von DRA (C-DRA) und das ETKF-minus-Konstrukt (C-DRA-ETKF-minus) präzipitieren (Expression jeweils als biotinylierte Fusionsproteine). (2) In einem semiquantitativen ELISA wurde die Bindung von biotinyliertem C-DRA, C-DRA-ETKFminus und weiteren C-DRA-Konstrukten mit mutiertem PDZ-Interaktionsmotiv (ETKI, ETKL, ETKV, ETKG, ETKA, ETKF-A) an die PDZ-Domänen der Adapterproteine getestet. (3) In einem quantitativen ELISA, unter Verwendung von biotinylierten DRA- und CFTR-Peptiden, wurde die Affinität der Interaktion von DRA zu E3KARP bzw. NHERF mit der von CFTR verglichen.

Ergebnisse: (1) Die vier C-terminalen Aminosäuren von DRA, Glutamat - Threonin - Lysin - Phenylalanin (ETKF), stellen ein PDZ-Interaktionsmotiv dar. (2) Obwohl das C-terminale Phenylalanin (F) nicht der Konsensus-Sequenz E/D - S/T - X - L/V entspricht, ist die Interaktion hochspezifisch, wobei das Phenylalanin nur durch Leucin ersetzt werden kann. (3) DRA bindet bevorzugt an die 2. PDZ-Domäne von E3KARP. Die Affinität dieser Interaktion ist mit einer KD von 1866 +/- 381 nM etwa um den Faktor 5-6 geringer als die Interaktion von CFTR mit den PDZ-Domänen von NHERF und E3KARP.

Diskussion: Die Interaktion von DRA mit der 2. PDZ-Domäne von E3KARP macht eine gemeinsame Lokalisation und/oder Regulation von DRA und NHE3 im Rahmen der NaCl-Resorption durch Dimerisierung der PDZ-Adapterproteine wahrscheinlich. Die erste PDZ-Domäne könnte dann zur Bindung von gemeinsamen Signaltransduktions-Proteine dienen. Für NHERF ist ein solches Protein bereits charakterisiert: EPI64. Es weist eine ungefähr 200-Aminosäuren-lange TBC/rab-GAP Domäne auf, welche für die Fusion von Vesikeln mit der apikalen Membran bedeutsam sein könnte.

Introduction: DRA (down regulated in adenoma) is an intestinal anion exchanger (Cl-/HCO3-). Its functional disorder causes congenital chloride loosing diarrhea, a hereditary disease in parts of Finland. DRA mediates electroneutral NaCl-Resorption in the distal Ileum and proximal Colon together with the Na+/H+-Exchanger NHE3. It has been shown that NHE3 binds with its C-Terminus to the 2nd PDZ (PSD 95, Disc large, ZO-1) domain of the adapter proteins E3KARP (NHE3 Kinase A Regulatory Protein) and NHERF (NHE3 Regulatory Factor). This interaction is required for cAMP mediated inhibition and apical localization of NHE3. The C-terminal four amino acids of DRA are ETKF (glutamate-threonine-lysine-phenylalanine), resembling a PDZ interaction motif. Based on the known functional linking of DRA and NHE3 it seems reasonable to suppose, that DRA may also bind to one of the PDZ domains of E3KARP and/or NHERF with its PDZ interaction motif, maintaining an additional structural link.

Aim of the thesis: Testing whether DRA binds to the PDZ domains of E3KARP and NHERF and to measure the affinity.

Methods: (1) Expression of the different domains ('full length', 1st PDZ-Domain, 2nd PDZ-Domain and C-Terminus) of E3KARP and NHERF as His-Tag-fusion proteins and measuring, whether they precipitate the C-Terminus of DRA (C-DRA) and the ETKF-minus-construct (C-DRA-ETKF-minus), both expressed as biotinylated fusion proteins. (2) The interaction of biotinylated C-DRA, C-DRA-ETKFminus and additional C-DRA-constructs expressing a mutated PDZ interaction motif (ETKI, ETKL, ETKV, ETKG, ETKA, ETKF-A) with the PDZ domains of the adapter proteins was measured using a semi quantitative ELISA. (3) Comparison of the interaction of DRA with NHERF and E3KARP with those of CFTR using biotinylated DRA- and CFTR-peptides in a quantitative ELISA.

Results: (1) The four C-terminal amino acids of DRA, glutamate - threonine - lysine - phenylalanine (ETKF) resemble a PDZ Interaction motif. (2) Although the C-terminal phenylalanine does not match the consensus sequence E/D - S/T - X - L/V, this interaction is very specific, because the phenylalanine could only be substituted by a leucine. (3) The DRA peptide binds with highest affinity to the second PDZ domain of E3KARP. The affinity of this interaction (KD 1866 +/- 381 nM) is approximately 5 - 6 times lower than the interaction of CFTR with the PDZ domains of NHERF and E3AKRP.

Discussion: The interaction of DRA with the second PDZ domain of E3KARP probably allows a colocalisation and/or regulation of DRA and NHE3 facilitating NaCl absorption by dimerization of the PDZ adapter proteins. In such a model, the first PDZ domain remains available for common signal transduction proteins. Such a protein is already characterised for NHERF: EPI64. It contains an approximately 200 amino acid long TBC/rab-GAP domain, which could be important for the fusion of vesicles with the apical membrane.