Elektrophysiologische Untersuchungen an Aminosäuretransporter des Systems SN1

Abstract

Der natrium- und protonengekoppelte Aminosäuretransporter SN1 ist verantwortlich für die Aufnahme von Aminosäuren, die in den Seitenketten Stickstoff enthalten: Histidin, Asparagin und Glutamin. Diese Substratspezifität ist identisch mit der des Aminosäuretransportsystems N. SN1 ist der wichtigste Glutamintransporter. Vor allem wird er in Astrozyten und Hepatozyten exprimiert. In diesen Zellen vermittelt SN1 sowohl Glutaminaufnahme als auch –freisetzung. Der Transport ist gekoppelt an Natrium und Protonen. Die SGK ist eine aldosteron- und zellvolumenregulierte Kinase, die in vielen Geweben wie Niere, Darm, Pankreas, und ZNS gefunden wird. In der vorliegenden Arbeit wurde der Aminosäuretransporter SN1 elektrophysiologisch und durch Fluxmessungen untersucht. Hierfür wurde SN1 in Oozyten exprimiert und mit Voltage-Clamp und Uptake Experimenten untersucht. In der Charakterisierung des SN1-Transporters zeigte sich eine Abhängigkeit des Glutaminstroms IGln von der extrazellulären Glutamin- und Natriumkonzentration. Die substratinduzierten Ströme IGln zeigten eine Stimulation nicht nur durch Erhöhung der Glutamin- und Natriumkonzentration, sondern auch durch Hyperpolarisation und Alkalinisierung der Zelle. Eine Ansäuerung der Zelle auf pH6 inhibierte den Glutaminstrom. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich außerdem mit dem Einfluss der Proteinkinasen SGK1, SGK3 und PKB auf den SN1-Transporter und mit der Regulation des SN1-Transporters durch die Ubiquitin Ligase Nedd4-2. Um die Regulation des SN1 zu untersuchen, wurden die substratinduzierten Ströme IGln elektrophysiologisch und die radioaktiven Glutamin-Uptakes in Oozyten bestimmt, die für SN1, Ubiquitin Ligase Nedd4-2 und/oder konstitutiv aktive Serum- und Glukokortikoid-abhängige Kinase S422DSGK1, ihre Isoform SGK3 und konstitutiv aktive Proteinkinase B (T308D,S473DPKB) kodierten. Die Koexpression der Proteinkinasen und des SN1-Transporters führten zu einer 2 bis 4-fachen Stimulation des durch Glutamin induzierten Stroms IGln. Die Koexpression von Nedd4-2 und SN1 hemmt den SN1-vermittelten Transport, während diese Hemmung durch die zusätzliche Koexpression von SGK1, SGK3 und PKB wieder aufgehoben wird. SN1 ist Ziel der Ubiquitin Ligase Nedd4-2, die durch die Serum- und Glukokortikoid-regulierte Kinase SGK1, ihre Isoform SGK3 und durch Proteinkinase B inaktiviert wird. Die vorliegende Arbeit konnte anhand dieser Methode die Erkenntnisse des elektrogenen Transports des Aminosäuretransporters des Systems SN1 bestätigen und korrigieren, sie aber auch durch neue Ergebnisse, wie die physiologische Regulation, erweitern.

SN1 mediates amino acid transport with a substrate specifity identical to the amino acid transport system N. It is mainly expressed in astrocytes and hepatocytes and presumably accomplishes Na+ coupled glutamine uptake and efflux in those cells. The transport is coupled to exit of H+, which balances the charge of Na+ cotransport. When expressed in Xenopus laevis oocytes, substrate induced currents are observed, which were used to characterise the transporter. The present study was performed to explore the nature of these currents and elucidate the sensitivity of SN1 to regulation by the ubiquitin ligase Nedd4-2 and the serum and glucocorticoid dependent kinases 1 and 3 (SGK1,3) and protein kinase B (PKB). Nedd4-2 has previously been shown to regulate abundance of channel proteins in the plasma membrane, an effect reversed by SGK1 and its isoform SGK3. cRNA encoding SN1, Nedd4-2 and/or the respective kinases were injected into Xenopus oocytes and substrate induced currents or radioactive glutamine uptake taken as a measure of transport activity. The substrate- induced currents were enhanced by increasing glutamine and/or Na+ concentrations and by hyperpolarization. Moreover, substrate induced currents were stimulated by alkalinization (pH 8.0) and inhibited by acidification (pH 6.0). Coexpression of Nedd4-2 markedly downregulates the SN1 mediated transport, an effect reversed by coexpression of the constitutively active S422DSGK1, SGK3 and constitutively active human T308D,S473DPKB. It is concluded that SN1 is a target for the ubiquitin ligase Nedd4-2, which is inactivated by the serum and glucocorticoid inducible kinases SGK1, its isoform SGK3 and protein kinase B.