Evaluation der HER-2/neu-Genamplifikation an Tumorabklatschpräparaten von Mammakarzinomen mittels FISH und deren Wertigkeit im Vergleich zur immunhistochemischen membranassoziierten Proteinüberexpression

Abstract

Die Kenntnis des HER-2/neu-Status von Mammakarzinomzellen ist zur Entscheidung bezüglich einer Immuntherapie mit Herceptin® notwendig. Dieser humanisierte monoklonale Antikörper ist gegen das HER-2/neu-Rezeptorprotein gerichtet, dessen Überexpression auf der Zellmembranoberfläche Voraussetzung für eine wirksame Therapie ist. In den meisten Fällen beruht eine Proteinüberexpression auf einer Amplifikation des HER-2/neu-Gens. In der vorliegenden Arbeit wurde der HER-2/neu-Status von 150 Mammakarzinomen mittels FISH untersucht und mit der immunhistochemischen, membranassoziierten Überexpression des HER-2/neu-Rezeptorproteins verglichen. Die Bestimmung einer Genamplifikation mittels FISH erfolgte an Tumorabklatschpräparaten mit dem PathVysion (TM) HER-2/neu DNA Sonden-Kit der Firma Vysis. Zur Beurteilung der Proteinüberexpression mittels IHC an Formalin-fixierten, in Paraffin-eingebetteten Gewebeproben diente der monoklonale Antikörper CB11 der Firma Novocastra oder der polyklonale Kaninchen Anti-human c-erbB-2 Onkoprotein-Antikörper der Firma Dako. Die FISH war in 133 der 150 angefärbten Tumorabklatschpräparate erfolgreich. Nach den Kriterien der HER-2/CEP17-Ratio zeigten 10,5% der Fälle eine Amplifikation des HER-2/neu-Gens. Bei ausschließlicher Bewertung der Absolutzahl des HER-2/neu-Sondensignals mit Berechnung der durchschnittlichen HER-2/neu-Genkopienzahl pro Tumorzellkern wiesen 9,0% der Fälle eine "low level"- und 10,5% der Fälle eine "high level"-Amplifikation auf. Die immunhistochemischen Scores wurden aus den Routinebefunden des Institutes für Pathologie der Universität Tübingen übernommen und in 20,3% der Fälle als schwach positiv (2+) und in 11,3% der Fälle als stark positiv (3+) beurteilt. In einem Fall (0,7%) war eine sichere Zuordnung nicht möglich (2+ - 3+). Eine stark positive Proteinüberexpression ging bis auf eine Ausnahme immer mit einer "high level"-Amplifikation einher. Unter den Mammakarzinomen mit schwach positiver Proteinüberexpression fand sich nur in 18,5% der Fälle eine "low level"-Amplifikation bezüglich der durchschnittlichen HER-2/neu-Genkopienzahl, während die HER-2/CEP17-Ratio stets nicht-amplifizierte Werte aufwies. Sowohl die FISH als auch die IHC sind aufgrund ihrer Durchführbarkeit und Auswertung zur Bestimmung des HER-2/neu-Status von Mammakarzinomzellen geeignet. Für die FISH-Methode stellt das Tumorabklatschpräparat eine geeignete Alternative zum Paraffinschnitt dar, wobei seine Vorteile in der schnelleren Präparatherstellung ohne Formalinfixierung, Paraffineinbettung und Schnittanfertigung sowie dem weniger aufwendigen Färbeprotokoll und der Auswertung ganzer Tumorzellkerne in Einzelzellage begründet sind. Allerdings ist beim Tumorabklatschpräparat die Anzahl der anfertigbaren Präparate und damit durchführbaren Färbungen limitiert und der Asservierungsaufwand deutlich höher als beim Schnittpräparat mit routinemäßiger Aufbewahrung der Paraffinblöcke. Der Ergebnisvergleich zwischen FISH und IHC zeigte eine hohe Korrelation (93,3%) zwischen "high level"-amplifizierten und stark positiv (3+) proteinüberexprimierenden Mammakarzinomen. In diesen Fällen bietet die FISH keine zusätzlichen Informationen. Im Falle einer schwach positiven (2+) Überexpression des HER-2/neu-Rezeptorproteins sollte allerdings eine Nachtestung mittels FISH erfolgen, da sonst eine therapierelevante Genamplifikation übersehen werden könnte.

The knowledge of HER-2/neu status in breast cancer cells is required for a decision regarding a therapy with Herceptin®. This humanized monoclonal antibody is directed specifically against the HER-2/neu protein whose overexpression on the membrane surface is a prerequisite for an effective therapy. In most cases protein overexpression is associated with HER-2/neu gene amplification. In this study the HER-2/neu status of 150 breast cancer patients was determined by FISH and compared with the immunohistochemical membrane associated protein overexpression. The evaluation of gene amplification in breast cancer imprint preparations using FISH was done with the PathVysion (TM) HER-2/neu DNA probe kit (Vysis). For the determination of an overexpression using IHC in formalin-fixed paraffin-embedded tissue probes one monoclonal (CB11, Novocastra) and one polyclonal (anti-human c-erbB-2, Dako) antibody was used. FISH was successful in 133 of the 150 stained imprint preparations. Based on the HER-2/CEP17 ratio criteria 10.5% showed a gene amplification. Using the absolute HER-2/neu gene criteria 9.0% exhibited a "low level" and 10.5% a "high level" amplification. The immunohistochemical scores were taken from diagnostic findings of the Institute of Pathology at the University of Tübingen. Low positive (2+) staining was found in 20.3% and high positive (3+) staining in 11.3% of the 133 cases. One case could not be categorized exactly (2+ - 3+). All but one case with a 3+ - overexpression also showed a "high-level" amplification. Within the cases with a 2+ - overexpression only 18.5% exhibited "low level" amplification whereas the HER-2/CEP17 ratio did not show any amplification. FISH as well as IHC are adequate methods for HER-2/neu status determination because of their feasibility and evaluation. For FISH, staining the imprint preparation is a suitable alternative to staining the paraffin-embedded tissue. The advantages of imprint preparations are a faster creation without formalin fixation, paraffin embedding and tissue sectioning as well as a less time-consuming staining protocol and the evaluation of separate complete nuclei. However the amount of producible imprint preparations is limited and therefore so are the staining possibilities. The comparison of FISH and IHC results showed a high correlation (93.3%) between "high level" amplified and high positive (3+) overexpressed breast cancer cells. In these cases FISH does not provide any further information. In case of low positive (2+) overexpression the tissue should additionally be tested using FISH since a therapy relevant gene amplification could be overseen.