Vergleich der Nachweisverfahren von Candida - DNA mittels PCR - ELISA, einer gattungsspezifischen Candida - Sonde im LightCycler (TM), Gelelektrophorese, Sequenzierung und der mikrobiologischen Untersuchung bei intensivmedizinisch betreuten Patienten

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die zur Verfügung stehenden Methoden zum Nachweis von Candida DNA mit der Routinediagnostik verglichen. Untersucht wurden Proben von intensivmedizinisch betreuten Patienten sowie Vollblutproben eines gesunden Probanden, die mit C.albicans, C.glabrata, C.tropicalis, C.krusei, C.lusitaniae und C.parapsilosis versetzt wurden. Bei den Patientenproben handelte es sich um Proben aus dem oberen Respirationstrakt, Proben aus dem Bauchraum, Vollblutproben sowie Katheterurinproben. Alle Proben wurden nach der manuellen Extraktion mittels PCR - ELISA untersucht und das PCR - Produkt außerdem in den LightCycler™ eingesetzt. Weiterhin wurde von allen Proben eine Gelelektrophorese angefertigt sowie alle Proben, die in mindestens einer der anderen Untersuchungen ein positives Ergebnis zeigten, einer Sequenzierung unterzogen. Um die kulturelle Untersuchung als Standartmethode abzulösen, müssten die molekularbiologischen Methoden jedoch nicht nur schneller zu Ergebnissen führen, sondern auch zur exakten Speziesbestimmung in der Lage sein. Mischinfektionen dürfen nicht zu falschen Ergebnissen führen Da diese Kriterien von keiner der angewandten Methoden allein erfüllt werden, wäre eine Verbesserung der Routinediagnostik nur durch eine Kombination dieser Methoden, zum Beispiel von Gelelektrophorese und Sequenzierung , zu erreichen.

In this thesis, available methods for detection of Candida DNA have been compared to routinely performed diagnostic methods. Specimens of intensive care unit patients as well as whole blood samples of healthy individuals spiked with C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis C. lusitaniae und C. parapsilosis have been tested. Patient specimens were gained from the upper respiratory tract, from ascites or from urine catheterisation. All specimens were analyzed after manual DNA extraction by PCR-ELISA and Light Cycler assays. Furthermore, PCR products were analyzed by gel electrophoresis and, in case of a positive result, sequenced. In order to establish molecular detection methods in routine, they have to be not only fast, but they also must allow exact species identification. Mixed infections must not lead to false results. As this criteria mentioned above are not fulfilled by any of the investigated methods, ideal routine diagnosis can only be reached by a combination of these methods, such as a combination of gel electrophoresis and sequencing.