Modifizierte Nucleoside als potenzielle Tumormarker beim Mammakarzinom

Abstract

Modifizierte Nucleoside, welche in der RNA posttranskriptionell durch zahlreiche Modifikationsenzyme entstehen, zirkulieren frei im Blut, werden in den Urin ausgeschieden und können dort nachgewiesen werden. Bei verschiedenen malignen Tumorerkrankungen wurden sie in abnorm hohen Konzentrationen im Urin nachgewiesen und daher als potenzielle Tumormarker vorgeschlagen.

Um zu untersuchen, inwiefern durch Bestimmung der Nucleosidlevel zwischen gesunden und an einem Mammakarzinom erkrankten Individuen unterschieden werden kann, wurden in der vorliegenden Arbeit die Urine (Spontanurin) von 101 gesunden Probandinnen im Alter zwischen 15 und 78 Jahren sowie von 68 präoperativen Mammakarzinompatientinnen der Tumorstadien Cis (8 Fälle), T1 (32 Fälle) und T2 (22 Fälle) sowie 6 Fällen unbekannter Stadien und der Gradingstadien G1, G2 und G3 bei den T1- und T2-Tumoren im Alter zwischen 34 und 83 Jahren auf ihre Nucleosidkonzentrationen untersucht. Die Nucleoside wurden aus den Proben mittels Affinitätschromatographie unter Einsatz von Phenylboronsäure extrahiert und die Konzentrationen durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (reversed-phase high-performance liquid chromatography [RP-HPLC]) nach der Internen-Standard-Methode analysiert. Die auf die Kreatininkonzentrationen bezogenen Nucleosidlevel wurden zwischen der Kontroll- und der Mammakarzinomgruppe sowohl durch klassische statistische Verfahren als auch durch den Einsatz eines Neuronalen Netzes (Artificial Neural Network [ANN]) verglichen, wobei in erstgenannten auf statistisch signifikante Unterschiede der einzelnen Nucleoside überprüft wurde und mittels des ANN das gesamte Nucleosidprofil betrachtet wurde. Des Weiteren wurden die Werte der konventionellen Tumormarker beim Mammakarzinom CA 15-3 und CEA in der Gruppe der Brustkrebspatientinnen erfasst und mit den erhaltenen Daten bezüglich der Nucleoside verglichen.

Von den 12 in die klassische Auswertung eingegangenen Nucleosiden, darunter vier nichtmodifizierte (Adenosin [A], Cytidin [C], Guanosin [G], Uridin [U]) und acht verschiedenartig modifizierte (1-Methyladenosin [M1A], 3-Methyluridin [M3U], 1-Methylinosin [M1I], 1-Methylguanosin [M1G], 2-Methylguanosin [M2G], Pseudouridin [Pseu], Inosin [I] und Xanthosin [X]), war eine statistisch signifikante Erhöhung in der Gruppe der Mammakarzinompatientinnen bei Pseudouridin, Inosin, 3-Methyluridin, 1-Methylinosin sowie Guanosin - also vier modifizierten und einem nichtmodifizieten Nucleosid - zu beobachten. Bezüglich der Spezifität und Sensitivität ergaben sich für Pseudouridin bei einer Spezifität von 95,0% eine Sensitivität von 7,4%, für Inosin von 95,0% / 22,1%, für 3-Methyluridin von 94,1% / 37,3%, für 1-Methylinosin von 95,0% / 23,9% und für Guanosin von 94,9% / 12,0%. In die Auswertung durch das Neuronale Netz, bei der die Nucleoside nicht nur einzeln betrachtet wurden, sondern in welcher das gesamte Muster Berücksichtigung fand, gingen bis auf Guanosin dieselben Nucleoside ein. Hierbei ergaben sich eine Spezifität von 83,4% sowie eine Sensitivität von 73,5%. Für die herkömmlichen Tumormarker beim Mammakarzinom CA 15-3 und CEA ergab sich anhand der Werte aus der Gruppe der Brustkrebspatientinnen für die Tumorstadien T1 und T2 eine Sensitivität von 8,1% für CA 15-3, von 9,7% für CEA sowie von 14,5% für CA 15-3 und/oder CEA bei unbekannter Spezifität, da keine Werte der Tumormarker für das Kontrollkollektiv vorlagen.

Modified nucleosides are formed posttranscriptionally in RNA by a variety of modification enzymes. They circulate in the blood stream and are excreted in the urine where they can be detected. In different malignant diseases they were found in elevated concentrations in the urine and therefore they have been suggested as potential tumor markers.

In order to examine if healthy individuals and patients with breast cancer can be discriminated by the determination of the nucleoside levels, in this study spontaneous urine samples of 101 healthy women in the age between 15 and 78 years and 68 preoperative women with breast cancer with the tumor stages Cis (8 cases), T1 (32 cases) and T2 (22 cases) and 6 cases of unknown stages and the grading G1, G2 and G3 in the T1 and T2 tumors in the age between 34 and 83 years were studied with respect to their nucleoside concentrations. The nucleosides were extracted from the samples by affinity chromatography using phenylboronate gel and the concentrations were analyzed by reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) applying the internal standard method. The nucleoside levels expressed in relation to the creatinine levels were compared between the control and the breast cancer group by both classical statistical methods and the use of an artificial neural network (ANN). With the first method statistically significant differences between the individual nucleosides and with the ANN method, differences between the whole patterns were examined. In addition, the levels of the conventional tumor markers in breast cancer, e.g. CA 15-3 and CEA, were compared with the data on the nucleosides.

Twelve nucleosides were used for the classical analysis, among them the four normal nucleosides (adenosine [A], cytidine [C], guanosine [G], uridine [U]) and eight differently modified nucleosides (1-methyladenosine [M1A]), 3-methyluridine [M3U], 1-methylinosine [M1I], 1-methylguanosine [M1G], 2-methylguanosine [M2G], pseudouridine [Pseu], inosine [I] and xanthosine [X]). A statistically significant elevation of the nucleoside levels in the breast cancer group was detected for pseudouridine, inosine, 3-methyluridine, 1-methylinosine and guanosine - four modified and one normal nucleoside. The specificities and sensitivities were as follows: pseudouridine 95.0% and 7.4%, inosine 95.0% and 22.1%, 3-methyluridine 94.1% and 37.3%, 1-methylinosine 95.0% and 23.9% and guanosine 94.9% and 12.0%. In the analysis using the artificial neuronal network, where the whole patterns of the nucleosides were taken into consideration and not the individual nucleosides, the same nucleosides except for guanosine were used. Here the specificity was 83.4% and the sensitivity 73.5%. For the conventional tumor markers CA 15-3 und CEA in the breast cancer group of the tumor stages T1 and T2 the sensitivity of CA 15-3 was 8.1%, of CEA 9.7% and of CA 15-3 and/or CEA 14.5% while the specificity was unknown because there were no tumor marker levels available for a control group.