Inhaltszusammenfassung:
Sphingolipidosen sind Lipidspeichererkrankungen mit häufig letalem Ausgang. Die Diagnose dieser Erkrankungen kann mit Hilfe von enzymatischen Bestimmungen in Extrakten aus Leukozyten erfolgen, wobei die Enzymaktivität pro Zellzahl als Messparameter verwendet wird. Ausgangsmaterial für routinemäßige Bestimmungen sind Leukozyten, die aus Vollblut mittels Dextransedimentation gewonnen werden. Aus einem Kollektiv gesunder Probanden werden Referenzbereiche ermittelt, deren Unterschreiten Hinweise auf eine Sphingolipidose ergeben. Diagnostische Probleme können in unteren Grenzbereichen auftreten. Um diesen unteren Grenzbereich exakter bestimmen zu können, wurden in dieser Arbeit zwei Ansätze verfolgt: Erstens wurde untersucht, zu welchen Anteilen die betreffenden Enzyme in den unterschiedlichen Leukozytenfraktionen (getrennt über Dichtegradientenzentrifugation und anschließender MACS-Separation) vorhanden sind, um anstelle der Gesamtleukozyten als Bezugssystem die Zusammensetzung der isolierten Leukozyten über Gewichtungsfaktoren mitberücksichtigen zu können. Dabei zeigte sich, dass im Durchschnitt nach der Zellisolierung in den Monozyten ca. 4-5mal, in den Granulozyten ca. 2mal höhere Enzymaktivitäten enthalten sind als in Lymphozyten. Ein weiteres Problem in diesen Grenzbereichen kann sich dadurch ergeben, dass die häufig per Post versandten Blutproben bei der Untersuchung nicht ganz frisch sind und dadurch bereits vor der Zellisolierung, oder vermehrt bei der Zellisolierung durch Degranulation, einen Teil ihrer Enzyme verlieren, was zu falsch erniedrigten Werten führt. Deshalb wurde der Einfluss der Degranulation genauer untersucht. Hier war es v.a. hilfreich, dass die Blutzellbestimmung mit Hilfe des Bayer ADVIA 120 routinemäßig durchgeführt wurde, da dieses Gerät Granulozyten und Monozyten von den übrigen Leukozyten über deren Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität unterscheidet: Kommt es zu einer Degranulation, also u.a. zu einem Verlust der MPO, so ist das an einer Linksverschiebung der Granulozyten- und Monozytenwolken erkennbar (X-Achse: MPO-Aktivität). Degranulationsprozesse wurden sowohl bei der Zellisolierung (mechanischer Stress) als auch durch spezielle Faktoren (Cytochalasin B und N-fMLP) analysiert. Neben diesen Messungen am Bayer ADVIA 120 wurde parallel die Ausschüttung der MPO aus den Granulozyten/Monozyten mit Hilfe eines ELISAs bestimmt sowie die von vier sphingolipidabbauenden Enzymen (Beta-Galaktosidase-Defekt bei GM1-Gangliosidose, Morquio B; Arylsulfatase-A-Defekt bei metachromatischer Leukodystrophie; Hexosaminidase-A-Defekt bei Morbus Tay-Sachs; Gesamthexosaminidase-Defekt bei Morbus Sandhoff). Die Ergebnisse zeigten eine gleiche Tendenz hinsichtlich des Degranulationsverhaltens der MPO und der sphingolipidabbauenden Enzyme, wodurch aus den Bayer ADVIA 120-Grafiken im Rahmen der routinemäßigen Blutbilderstellung Rückschlüsse über das Ausmaß der Degranulation gezogen werden können. Aufgrund dieser beiden erarbeiteten Fakten (relative Enzymaktivitäten in den einzelnen Zellfraktionen der Leukozyten und der Registrierung des Ausmaßes der jeweiligen Degranulation der Probe durch Messung am Bayer ADVIA 120) ist es möglich, durch entsprechende Gewichtungsfaktoren die Aktivitäten von sphingolipidabbauenden Enzymen in den unteren Grenzbereichen genauer und eindeutiger feststellen zu können.