Bestimmung von sphingolipidabbauenden Enzymen in Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten zur Optimierung der Labordiagnostik bei Sphingolipid-Speichererkrankungen

Abstract

Sphingolipidosen sind Lipidspeichererkrankungen mit häufig letalem Ausgang. Die Diagnose dieser Erkrankungen kann mit Hilfe von enzymatischen Bestimmungen in Extrakten aus Leukozyten erfolgen, wobei die Enzymaktivität pro Zellzahl als Messparameter verwendet wird. Ausgangsmaterial für routinemäßige Bestimmungen sind Leukozyten, die aus Vollblut mittels Dextransedimentation gewonnen werden. Aus einem Kollektiv gesunder Probanden werden Referenzbereiche ermittelt, deren Unterschreiten Hinweise auf eine Sphingolipidose ergeben. Diagnostische Probleme können in unteren Grenzbereichen auftreten. Um diesen unteren Grenzbereich exakter bestimmen zu können, wurden in dieser Arbeit zwei Ansätze verfolgt: Erstens wurde untersucht, zu welchen Anteilen die betreffenden Enzyme in den unterschiedlichen Leukozytenfraktionen (getrennt über Dichtegradientenzentrifugation und anschließender MACS-Separation) vorhanden sind, um anstelle der Gesamtleukozyten als Bezugssystem die Zusammensetzung der isolierten Leukozyten über Gewichtungsfaktoren mitberücksichtigen zu können. Dabei zeigte sich, dass im Durchschnitt nach der Zellisolierung in den Monozyten ca. 4-5mal, in den Granulozyten ca. 2mal höhere Enzymaktivitäten enthalten sind als in Lymphozyten. Ein weiteres Problem in diesen Grenzbereichen kann sich dadurch ergeben, dass die häufig per Post versandten Blutproben bei der Untersuchung nicht ganz frisch sind und dadurch bereits vor der Zellisolierung, oder vermehrt bei der Zellisolierung durch Degranulation, einen Teil ihrer Enzyme verlieren, was zu falsch erniedrigten Werten führt. Deshalb wurde der Einfluss der Degranulation genauer untersucht. Hier war es v.a. hilfreich, dass die Blutzellbestimmung mit Hilfe des Bayer ADVIA 120 routinemäßig durchgeführt wurde, da dieses Gerät Granulozyten und Monozyten von den übrigen Leukozyten über deren Myeloperoxidase (MPO)-Aktivität unterscheidet: Kommt es zu einer Degranulation, also u.a. zu einem Verlust der MPO, so ist das an einer Linksverschiebung der Granulozyten- und Monozytenwolken erkennbar (X-Achse: MPO-Aktivität). Degranulationsprozesse wurden sowohl bei der Zellisolierung (mechanischer Stress) als auch durch spezielle Faktoren (Cytochalasin B und N-fMLP) analysiert. Neben diesen Messungen am Bayer ADVIA 120 wurde parallel die Ausschüttung der MPO aus den Granulozyten/Monozyten mit Hilfe eines ELISAs bestimmt sowie die von vier sphingolipidabbauenden Enzymen (Beta-Galaktosidase-Defekt bei GM1-Gangliosidose, Morquio B; Arylsulfatase-A-Defekt bei metachromatischer Leukodystrophie; Hexosaminidase-A-Defekt bei Morbus Tay-Sachs; Gesamthexosaminidase-Defekt bei Morbus Sandhoff). Die Ergebnisse zeigten eine gleiche Tendenz hinsichtlich des Degranulationsverhaltens der MPO und der sphingolipidabbauenden Enzyme, wodurch aus den Bayer ADVIA 120-Grafiken im Rahmen der routinemäßigen Blutbilderstellung Rückschlüsse über das Ausmaß der Degranulation gezogen werden können. Aufgrund dieser beiden erarbeiteten Fakten (relative Enzymaktivitäten in den einzelnen Zellfraktionen der Leukozyten und der Registrierung des Ausmaßes der jeweiligen Degranulation der Probe durch Messung am Bayer ADVIA 120) ist es möglich, durch entsprechende Gewichtungsfaktoren die Aktivitäten von sphingolipidabbauenden Enzymen in den unteren Grenzbereichen genauer und eindeutiger feststellen zu können.

The course of spingolipid storage diseases is often lethal. The diagnosis of this disease can be made by enzymatic measurement made out of leucocyte extracts. Measurement is expressed as enzymatic activity per cell count. Basic material for the routine tests are leukocytes which are extracted out of peripheral venous blood by dextran sedimentation. Reference values are made out of median values of a community of healthy probands. Under-running of a crtitical value is a diagnostic hint for a spingolipid storage disease. Problems in this diagnostic procedure happen in the lower threshold. To further investigate this threshold and to make more exact reference values was the aim of this work. Therefore two appendages were made: First we investigated the distribution of the measured enzyme activities (beta-galactosidase deficiency in GM1 gangliosidosis, Morquio B; arylsulfatase A deficiency in metachromatic leucodystrophy; hexosaminidase A deficiency in Tay-Sachs disease; beta-hexosaminidases A and B deficiency in Sandhoff’s disease) between the different leucocytes (seperated by density gradient centrifugation and adjacent separation by MACS method) to be able to use the different subgroup distribution of leucocytes as frame of reference via weighting factor. We could show that monocytes have 4-5 times, granulocytes approx. 2 times higher enzymatic activity than lymphocytes. Another problem is the fact that most samples arrive via mail and may therefore be in transit for some days. This means loss of enzymes into plasma before leucocytes are separated and enzymatic activity (in the cells) is measured and in consequence the attained values are false low. We therefore further investigated the influence of degranulation process. Blood cell count is made routinely by using ADVIA 120 (Bayer). This machine is able to distinguish granuloytes and monocytes from the rest of leucocyte subgroups by using their myeloperoxidase (MPO) activity. If degranulation happens - associated with loss of MPO – ADVIA diagram shows a left shift of granulocytic and monocytic pall (x-axis: MPO acitivity). Degranulation process was investigated under two conditions: cell separation (mechanic stress) and chemical stressors (cytochalasin B and N-fMLP). In addition to ADVIA 120 measurement we determined MPO distribution from granulocytes/monocytes by using ELISA as well as the distribution of the four enzymes involved in sphingolipid degradation. Our results show tendency of parallel behaviour between degranulation habits of MPO and enzymes involved in sphingolipid degradation. Using this concept it is now possible to combine results from routine cell count measurements made by Bayer ADVIA 120 and MPO measurement to make a statement concerning extent of degranulation. Conclusions: By considering the two results of this work (different distribution of enzymatic activity in leucocyte subgroups and measurement of degranulation degree by using MPO acitivity index) it is now possible to further distinguish and determine the lower threshold of sphingolipid-degradation enzymatic activites by using corresponding weighting factors.