Heteroplasmie und Segregationsmuster mitochondrialer Mutationen der Leberschen hereditären Optikusneuropathie

Abstract

Die Lebersche hereditäre Optikusneuropathie (LHON) gilt als Prototyp einer mitochondrial vererbten Erkrankung, deren Hauptmerkmale die maternale Vererbung, der durch eine mtDNA-Mutation verursachte Atmungskettendefekt und die Bedeutung quantitativ-stochastischer Prinzipien der Mitochondriengenetik für die Krankheitsmanifestation sind (Schwellenwerteffekt). Von anderen mitochondrialen Erkrankungen unterscheidet sich die LHON durch einige besondere Merkmale wie das vorwiegende Auftreten bei jungen Männern, die geringe Penetranz und ihr oligosymptomatisches Krankheitsbild. Diese Besonderheiten weisen daraufhin, dass in der LHON-Pathogenese gewebespezifische, umweltbedingte und andere genetische Faktoren eine wichtige Rolle spielen. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der Vererbungs- und Segregationseigenschaften von LHON-Mutationen als wichtigsten pathogenetischen Faktor am Beispiel von LHON-Familien mit Heteroplasmie G3460A Mutation. Die Vererbung wurde untersucht, indem quantitative Änderungen des Heteroplasmiegrades zwischen Angehörigen verschiedener Generationen einer Familie analysiert wurden. Hierzu konnten die Ergebnisse von 15 Transmissionsereignissen bei 23 Patienten und gesunden Anlagenträgern aus vier unverwandeten LHON-Familien herangezogen werden. Die Analyse der Segregationseigenschaften erfolgte in einer Longitudinalstudie über 5½ Jahre an fünf Patienten und gesunden Anlageträgern einer LHON-Familie. Zur Durchführung der Heteroplasmieanalysen diente ein Detektionsassay, das auf der Grundlage einer fluorophormarkierten Primerextensionsreaktion und PCR/RFLP-Analyse entwickelt wurde. Die Validität und Messgenauigkeit des Verfahrens konnten in Wiederholungsmessungen von Standardproben nachgewiesen werden. Das entwickelte Detektionsassay zeichnet sich durch seine Einsatzmöglichkeit als routinemäßiges Verfahren und Modifikationsfähigkeit zur Analyse weiterer Punktmutationen aus. Die Ergebnisse der Heteroplasmieanalysen zeigten tendenziell eine Zunahme des Heteroplasmiegrades in der Folgegeneration, während sich in der Longitudinalbeobachtung der mtGenotyp entweder quantitativ nicht veränderte oder aber eine deutliche Abnahme des relativen Anteils mutanter mtDNA-Allele zeigte. Die Befunde deuten darauf hin, dass in der Vererbung der G3460A Mutation vermutlich vorwiegend zufallsabhängige Mechanismen zu einem genetischen Drift führen, während negative Selektionsmechanismen des mutanten mtDNA-Allels in der Segregation auf der Ebene der hämatopoetischen Stammzellen eine Rolle spielen. In einer weiteren Untersuchung wurde die Heteroplasmieprävalenz der drei primären LHON-Mutationen anhand von Ergebnissen der molekulargenetischen Diagnostik an 167 Familien des Tübinger LHON-Kollektivs ermittelt. Sie ergab eine siebenfach höhere Prävalenz bei LHON-Familien mit einer G3460A (40%) oder T14484C (36.4%) Mutation gegenüber der G11778A (5.6%) Mutation. Diese Ergebnisse sprechen für genotypspezifische Unterschiede im Vererbungsmuster, Segregationsverhalten und Einfluss pathogenetischer Co-Faktoren der drei primären LHON-Mutationen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erlauben neue Einsichten in die Dynamik des mtGenotyps und die Bedeutung genotypspezifischer Faktoren in der Krankheitsentstehung. Unter diesem Eindruck entwickelt sich die LHON zunehmend zu einem in seinen molekularen Ursachen heterogenen Krankheitsbild oder wie Harding und Mitarbeiter (1995) festgestellt haben "LHON, in many ways the prototype of mitochondrial inheritance, may well turn out to be more etiologically complex than other human diseases associated with defects of mtDNA".

Leber's hereditary optic neuropathy (LHON) is considered the prototype of mitochondrial genetic disease. The hallmarks of mitochondrial genetic disease are a defect of the mitochondrial-bound oxidative phosphorylation system and the principles of maternal inheritance and quantitative-stochastic segregation of mitochondrial DNA (mtDNA) governing transmission and expression of disease (threshold effect). The distinguishable features of LHON are a predilection to affect young males, a low penetrance and the oligosymptomatic manifestation. These characteristics of LHON are suggestive of a disease mechanism that is tissue-specific, and dependant on both environmental and secondary genetic factors. The purpose of the present study is to investigate transmission and segregation characteristics of LHON mutations in families that carry the G3460A mutation. The transmission was analyzed by determining the quantitative changes in the degree of heteroplasmy in blood leucocytes between members of different generations of a family. The study comprised 15 incidences of mtDNA transmission in 23 patients and healthy family members from four unrelated LHON families. Analysis of mtDNA segregation characteristics was performed in a longitudinal observation over 5.5 years in five LHON patients and healthy family members. A specific detection assay was developed to quantitatively assess changes in the heteroplasmy level between generations of a family and longitudinally in individual cases. The validity and measurement accuracy of the detection assay, that is based on fluorescent-based primer-extension reaction and PCR/RFLP analysis, was demonstrated by repeated measurements of standard mtDNA samples. The detection assay proved to be of value as a routine procedure with the ability to be modified for the analysis of other point mutations. The results of the heteroplasmy analysis showed an increase in mutation load in subsequent generations, while in the longitudinal observation the mtDNA genotype evidenced either no change or a decrease in the percentage of mutant mtDNA. The findings suggest that inheritance of the G3460A LHON mutation largely depends on random transmission resulting in a genetic drift of the mtDNA genotype. The longitudinal decrease in mutant mtDNA are indicative of negative selection mechanisms of the mutant mtDNA allele being active in segregation processes on the hematopoietic stem cells level. We further studied that heteroplasmy prevalence in 167 LHON families from the Tübinger LHON repository carrying one of the three primary LHON mutations. We found a sevenfold higher heteroplasmy prevalence in LHON families with a G3460A (40%) or T14484C (36,4%) mutation compared to the G11778A (5,6%) mutation. These results indicate genotype-specific differences in transmission, segregation characteristics and the role of other pathogenic factors between the three primary LHON mutations. The results of the present study give new insights into the mtDNA genotype dynamics and the role of genotype-specific factors in disease manifestation. These findings give further support to the notion that LHON is a disease entity with an increasingly heterogeneous molecular basis or to quote Harding and coworkers (1995) who said "LHON, in many ways the prototype of mitochondrial inheritance, may well turn out to be more etiologically complex than other human diseases associated with defects of mtDNA".