Nano Hydroxyapatite/Collagen, Nano Hydroxyapatite and Anodic Oxides on Titanium - Preparation, Characterization and Biological Responses -

Abstract

Aim The purpose of the present study is to develop, characterize and biologically evaluate a new surface for titanium implants to optimize osseointegration at the bone-implant interface.

Materials and Metholds After pretreatment procedure, rectangular cp titanium specimens were anodized in a galvanostatic mode with a current density of 70 A/m2 till different voltages using either 0.2 M H3PO4 solution or a mixture of 0.03 M calcium glycerophosphate (Ca-GP) and 0.15 M calcium acetate (CA) as electrolyte. Surface characterization were performed including morphology, roughness, wettability, chemical compositions and states of elements. UV-irradiation was performed for 1 hours under two 254 nm UV-light bulbs. Nano HA was synthesized and its structure was analyzed by XRD and TEM. Collagen type I (calf skin) was homogeneously mixed with nano HA sol, and then the mixture was coated on the Ti surfaces. In vitro studies including cytotoxicity, cell attachment and spreading, cell proliferation and alkaline phosphatase activity were investigated into anodic oxides, nano HA and nano HA/collagen surfaces by cell culture and evaluation with the SaOS-2 human osteoblast-like cell line, derived from a human osteosarcoma.

Results With an increase of anodizing voltages, the geometry of micro-pores in the anodic oxides increases in 0.2 M H3PO4 (up to ca. 0.5 µm) as well as in 0.03 M Ca-GP and 0.15 M CA (up to ca.2 µm). Phosphorus or calcium/phosphorus were incorporated into the surface oxides formed in different electrolytes, and existed in the form of phosphate and calcium phosphate in the anodised surfaces, respectively. The values of all contact angles of control (untreated) and anodised surfaces were in there range of 60º to 90º. Surface roughness was enhanced by anodic oxides within the range of 0.1-0.5 µm. Roughness was shown to decrease contact angles.The hydrophilicity of surface oxides was found to be enhanced significantly by UV irradiation, and however, the extent of the change of contact angles induced by UV irradiation was distinctly different. All the anodic oxides of titanium did not indicate cytotoxicity. Cell adhesion and proliferation were increased on anodic oxides, and the cells on anodic oxides showed irregular, polygonal growth and developed a number of lamellipodia and filopodia. In contrast, cells on the untreated surface showed more rounded and spread appearance with intense focal contacts and remarkable stress fibers. No correlation of ALP activity and the surface characteristics of the anodic oxides was demonstrated. Nano HA particles were synthesized in the range of 10-50 nm in size and in the shape of ellipsoid with relatively high crystallinity, which was increased as aging temperature increased but independent of aging time. Cells on nano HA and nano HA/collagen coatings showed a multipolar shape with some filopodia. Nano HA combined with collagen showed a certain sign of synergistic effect by significantly enhancing cell adhesion.

Conclusions Titanium surfaces were enhanced in roughness by anodic oxidation and their wettability showed the tendency opposite to that of roughness. UV irradiation significantly increased hydrophilicity of surface oxides. It was suggested that the porous structures of anodic oxides could act as positive attachment sites for cellular filopodia in their interaction with cells, while cells on the smooth surface attach and spread by focal contacts. Nano HA synthesized was 10-50 nm in size and relatively crystalline, affected by aging temperature but independent of aging time. Cells on nano HA and nano HA/collagen were multipolarized, and cellular adhesion was enhanced by collagen.

Ziele Ziel dieser Arbeit war es, eine neue Oberfläche zu entwickeln, zu charakterisieren und biologisch zu beurteilen, damit Titanimplantate die Osseointegration an der Knochen-Implantat-Grenzfläche optimieren.

Material und Methoden Nach der Vorbereitung wurden rechteckige cp Titanmuster galvanisiert, und zwar mit einer Stromdichte von 70A/m2 unter verschiedenen Spannungen mit Hilfe von 0,2M H3PO4 anodisierte Lösung oder einer Mischung von 0,03M Kalzium Glycerophosphate (Ca-GP) und 0,15M Kalziumacetat(CA) als Elektrolyt. Die folgende Oberflächencharakterisierung wurde ausgeführt: Morphologie, Rauheit, Wettability, chemische Zusammensetzung und Zustände von Elementen. Eine UV-Bestrahlung wurde 1 Stunden unter zwei 254nm UV-Glühbirnen ausgeführt. Nano HA wurde synthetisiert, und seine Struktur wurde von XRD und TEM analysiert. Kollagen Type I (Kalbsfell) war homogen gemischt mit nano HA sol .Die Mischung war dann auf den Titan-Oberflächen beschichtet. In vitro Studien, inklusive der Zytotoxizitäten, der Zelladhäsion und Verbreitung, wurden der Zellproliferation und der alkalischen Phosphatasen Aktivitäten in anodischer Oxide, nano-HA und nano-HA/Kollagen Oberfläche durch Zellkultur und Auswertung mit der SaOS-2 menschlichen osteoblasten Zellen, die aus einer menschlichen Osteosarcoma waren, durchgeführt.

Ergebnis Mit einer Steigerung der Anodenspannung steigert sich die Geometrie von Mikro-Poren in den anodicen Oxiden sowohl in 0,2M H3PO4 (bis zu ca. 0,5µm) als auch in 0,03M Ca-GP und 0,15M CA (bis zu ca. 2µm). Phosphor oder Kalzium/Phosphor wurden in die in verschiedenen Elektrolyten geformten Oberflächenoxide integriert. Phosphor und Kalzium wurden demonstriert, um in der Form von Phosphat und Kalziumphosphat in den anodisierten Oberflächen zu existieren. Die Werte von allen Kontaktwinkeln von Kontrolle (unbehandelt) und anodisierten Oberflächen war im Bereich von 60º zu 90º. Die Oberflächenrauheit wurde von anodicen Oxiden innerhalb des Bereichs von 0.1-0.5µm verbessert. Rauheit wurde gezeigt, Kontaktwinkel zu vermindern. Bezüglich der Hydrophile von Oberflächenoxiden wurde gefunden, daß sie signifikant von UV Bestrahlung verbessert werden. Das Ausmaß der Änderung der von UV- Bestrahlung herbeigeführten Kontaktwinkel war jedoch deutlich anders.

Alle die anodicen Oxide des Titans zeigten Zytotoxizität nicht an. Zelladhäsion und Zellproliferation wurden auf anodischen Oxiden gesteigert. Die Zellen auf anodischen Oxiden zeigten unregelmäßiges, polygonales Wachstum, die eine Anzahl von lamellipodia und filopodia entwickelten. Im Gegensatz dazu zeigten die Zellen auf dem Titan mehr gerundete und verbreitete Erscheinung mit intensiven fokalen Kontakten und bemerkenswerten stressigen Fibern. Keine Korrelation von ALP Aktivität und die Oberflächencharakterisierungen der anodischen Oxide wurden demonstriert.

Nano HA Partikel wurden im Bereich von 10-50nm in Größe und in der Form von ellipsoid mit relativ hoher Kristallinität synthetisiert. Ihre Anzahl nahm proportional zur Temperatur zu, aber verhielt sich unabhängig von der Zeit. Die Zellen auf nano HA und nano HA/Kollagen Anstriche zeigten eine multipolare Form mit irgendeinem filopodia. Nano HA kombiniert mit Kollagen zeigte ein sicheres Zeichen von synergistischem Effekt durch signifikantes Verbessern der Zelladhäsion.

Schlussfolgerungen Titanoberflächen wurden in Rauheit von anodicer Oxidation verbessert, und ihr wettability zeigte die entgegengesetzte Tendenz der Rauheit. UV Bestrahlung steigerte die Hydrophilie von Oberflächenoxiden signifikant. Es wurde empfohlen, daß die porösen Strukturen als positive attachmente Stellen für Zelluläre Filopodia in ihrer Interaktion mit Zellen wirken konnten, weil die Zellen auf der glatten Oberfläche durch fokale Kontakte anschließen und sich verbreiten. Synthetisierter Nano-HA wurden 10-50nm in Größe und relativ Kristallartig, von alternder Zeit davon betroffen, Temperatur, aber Unabhängigen altern zu lassen. Zellen auf Nano-HA und Nano-HA / Kollagen waren multipolarized, und zelluläre Adhäsion wurde von Kollagen verbessert.