Intrazellulärer Transport des Proteolipid Proteins in Oligodendrozyten

Abstract

Myelin ist eine um Nervenaxone gewundene, spezialisierte Membran, die durch ihre isolierende Eigenschaft die Nervenleitungsgeschwindigkeit beschleunigt. Oligodendrozyten bilden das Myelin im ZNS und gehören zu den metabolisch aktivsten Zellen des menschlichen Körpers. Sie erzeugen in den ersten Lebenswochen große Mengen an Myelinmembran, wozu ausgefeilte Protein- und Lipidsortierungsmechanismen erforderlich sind. Obwohl die Struktur und die Zusammensetzung von Myelin schon seit langem bekannt sind, weiß man wenig über die molekularen Mechanismen der Myelingenese. In dieser Arbeit wurden für die Myelinsortierung wichtige Interaktionen des Myelinhauptproteins Proteolipid-Protein (PLP) näher untersucht. PLP geht eine Protein-Lipid-Interaktion mit Detergens-unlöslichen Membranfraktionen (DRM; 'Myelinrafts') ein. Analog zu anderen polaren Zellen wird angenommen, dass Oligodendrozyten diese DRM's als Sortierungsweg für Proteine in die Myelinmembrandomäne verwenden. Bekannt ist nicht, wie die Assoziation von PLP mit 'Myelinrafts' zustande kommt. Die Struktur von PLP weist mit seinen Palmitoylierungen jedoch ein gut erforschtes Signal für die Zuordnung zu DRM's auf. Um den Einfluss der Palmitoylierungen zu prüfen, wurden für dieses Projekt zunächst mehrere unterschiedlich mutierte PLP-Konstrukte hergestellt, die weniger bzw. nicht mehr palmitoyliert werden und anschließend deren Anteil in 'Myelinrafts' bestimmt. Ein wichtiges Ergebnis war, dass die Palmitoylierung die Assoziation von PLP mit 'Myelinrafts' nicht verändert. Ferner wurde untersucht, ob Protein-Interaktionen Einfluss auf die Sortierung von PLP nehmen. Es konnte hier nun gezeigt werden, dass PLP mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG), Komplexe bildet, welche sich hauptsächlich in Aktin/a-Aktinin-reichen Membrandomänen an der Zelloberfläche befinden. MOG erhöht den Anteil an PLP in diesen Domänen. Vor allem aber wird MOG von mutiertem PLP (PLPmsd und PLPrsh) im Endoplasmatischen Retikulum (ER) zurückgehalten. PLPmsd und PLPrsh werden wegen ihrer falschen Struktur nicht aus dem ER transportiert und lösen u.a. die Pelizäus-Merzbacher-Krankheit aus. Die Ergebnisse dieser Arbeit können somit zum weiteren Verständnis der Myelinerkrankungen beitragen.

Specialized glial cells, oligodendrocytes and Schwann-cells, synthesize myelin as a multilamellar, compact membrane that ensheathes and insulates axons. During myelinogenesis myelin producing cells are the cells with the highest rate of metabolic activity in the human body synthesizing a vast amount of proteins and lipids. Little is known about the molecular mechanisms how the different molecules are sorted to the myelin membrane. The major myelin proteolipid protein (PLP) interacts with cholesterol and galactosylceramide enriched membrane domains in primary cultures of oligodendrocytes. These membrane domains represent a specialized form of lipid rafts, termed myelin rafts, which are characterized by their insolubility in the zwitterionic detergent 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS). These protein-lipid interactions are assumed to be critical for targeting PLP to the myelin membrane. The aim of this study was to identify the sorting determinant for association with the CHAPS-insoluble membrane fraction and for the targeting to the myelin membrane. Since PLP is palmitoylated at several sites, we tested the hypothesis that this particular post-translational lipid modification, may act as a sorting determinant by enhancing the affinity of PLP to the myelin membrane. We found that palmitoylation-deficient mutants of PLP/DM20, were less efficiently targeted to myelin membrane in primary cultures of oligodenrocytes. However, their association to the CHAPS-insoluble membrane fraction was not affected. We also addressed the question whether protein-protein interactions contribute to the proper sorting of PLP. By co-immunopreciptiation experiments we found that PLP forms a complex with the myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), and by immunoflourescence microscopy we found both proteins co-localized with actin/a-actinin on the cell surface in large membrane patches. Expression of MOG increased the targeting and/or retention of PLP in these actin-rich surface patches. We also co-expressed MOG with mutant forms of PLP that are associated with the severe dysmyelinating Pelizaeus-Merzbacher disease and are known to be retained in the endoplasmic reticulum (ER). Now we found that MOG was trapped with the mutant of PLP in the ER demonstrating that the transport of MOG and PLP are closely coupled. In summary, our results do not only enhance the knowledge of membrane trafficking in oligodendrocytes under physiological conditions but also contributes to the mechanisms of myelin membrane missorting as it occurs in dysmyelinating diseases such as the Pelizaeus-Merzbacher disease.