Induktion von c-Met-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten mit Hilfe dendritischer Zellen als Voraussetzung für einen späteren Einsatz in der Immuntherapie maligner Tumoren

Abstract

In einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung wurde ein vom Protoonkogen c-Met abgeleitetes HLA-A2-bindendes Peptid beschrieben. Da die Expression von c-Met mit Transformation, Malignität, Metastasierung und schlechter Prognose von Tumorerkrankungen korreliert, stellt es ein interessantes Zielmolekül für die Therapie maligner Tumoren mittels Immuntherapie dar. Unter Einsatz von dendritischen Zellen (DC) wird hierbei versucht, native zytotoxische T-Zellen (CTL) zu induzieren und damit eine primäre T-Zell-Antwort gegen die von den Tumorzellen exprimierten Oberflächenantigene, sogenannte Tumorantigene, zu initiieren, was zur spezifischen Lyse dieser Tumorzellen führt. In der vorliegenden Arbeit wird die Expression von c-Met durch humane Tumorzelllinien untersucht und sein Einsatz als mögliches neues Tumorantigen überprüft, um die Grundlagen für eine spätere Verwendung in der Immuntherapie maligner Erkrankungen zu schaffen. Zunächst wurde zur Identifikation geeigneter Zielzellen die c-Met Expression menschlicher Tumorzelllinien durch PCR- und Western-Blot-Technik überprüft. Danach erfolgte die Generierung von DC aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes, um sie zur Induktion einer antigenspezifischen CTL-Reaktion gegen das c-Met Epitop einzusetzen. Die Fähigkeit der CTL, c-Met exprimierende Zelllinien zu lysieren wurde in Standard-51Chromium-Release-Assays nachgewiesen. Hierbei dienten als Zielzellen sowohl endogen c-Met exprimierende Tumorzelllinien als auch mit synthetischem c-Met Peptid beladene Zellen sowie ursprünglich c-Met negative, mit c-Met RNA transfizierte Zielzellen. Der Ausschluss einer Lyse durch natürliche Killerzellen (NK) erfolgte durch den Einsatz der NK-sensitiven Tumorzelllinie K 562. Zusätzlich wurde die Antigenspezifität dieser Lyse in Cold-Target-Inhibition-51Chromium-Release-Assays überprüft. Ausserdem wurden Antikörperblockierungsexperimente gemacht, um die HLA-A2 Restriktion der Reaktion nachzuweisen. Um diese Versuche schließlich auch in einem autologen System zu demonstrieren, wurden als Zielzellen DC verwendet, die aus dem Blut des identischen Spenders hergestellt worden waren wie die eingesetzten CTL. Da zuvor der Ausschluss einer endogenen c-Met Expression der DC durch Western-Blot-Versuche erfolgt war, wurde eine Transfektion der DC mit Tumorzell-RNA einer c-Met positiven Tumorzelllinie durchgeführt. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die von den DC induzierten CTL in der Lage waren, sowohl in einem heterologen als auch autologen System c-Met exprimierende Zellen antigenspezifisch und HLA-restringiert zu erkennen und zu lysieren. Die Erkennung der Zielzellen erfolgte sowohl nach Einsatz eines synthetischen Peptids als auch nach Transfektion mit Tumorzell-RNA sowie bei endogen c-Met exprimierenden Tumorzelllinien. Ferner wurde demonstriert, dass viele epitheliale und hämatopoetische Tumorzelllinien, darunter Nierenzellkarzinome, Kolonkarzinome, Maligne Melanome, Ovarialkarzinome, Mammakarzinome und Multiple Myelome, c-Met exprimieren. Somit wurde dargelegt, dass das von vielen menschlichen Tumoren exprimierte c-Met Peptid ein neues Tumorantigen darstellt und daher als potenzielles Zielmolekül für Vakzinierungstherapien maligner Tumoren eingesetzt werden kann. Allerdings kann anhand der gewonnenen Daten keine Aussage über die Erzielbarkeit klinischer Erfolge oder über die damit verbundenen Risiken gewonnen werden. Da aber unter Verwendung anderer Tumorantigene bereits beachtliche Ergebnisse in klinischen Studien beschrieben worden sind, darunter monatelange Remissionen auch bei fortgeschrittenen Malignomen, und da die dabei erzielten Remissionen in keinem Fall mit gravierenden Nebenwirkungen oder therapielimitierenden Autoimmunphänomenen einhergegangen sind, kann diese Arbeit möglicherweise dazu beitragen, die Optionen für hoffnungsvolle Therapieansätze bei malignen Erkrankungen zu erweitern.

In a recently published paper a HLA-A2-binding peptide derived from the c-Met protein was identified. As the expression of c-Met correlates to malignant transformation, invasiveness and bad prognosis of malignant diseases, it is an interesting target molecule for the therapy of malignant tumors using immunotherapies. Main principle of that kind of immunotherapy is to use dendritic cells (DC) for the induction of cytotoxic T cells (CTL) to trigger a primary T cell response against surface proteins (so called tumor rejection antigenes) of target cells and initiate therefore a specific lysis of malignant tumor cells. This dissertation analyzed the expression of c-Met on human tumor cells and its possible function as a new tumor rejection antigene to achieve basic knowledge about a future application of this peptide in immunotherapies against malignant diseases. As a first step possible target cells were identified by testing the c-Met expression of human tumor cell lines using PCR and Western Blotting methods. Then DCs were generated from adherent peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) of voluntary blood donators for the induction of an antigene-specific CTL response against the c-Met peptide. The ability of these CTLs to lyse c-Met expressing cell lines in a specific way was demonstrated in standard-51chromium-release-assays. Therefore not only tumor cells endogenously expressing the c-Met proto-oncogene but also tumor cells pulsed with synthetic peptide and autologous DCs transfected with whole tumor RNA were utilized. The lysis of tumor cells through natural killer cells (NK) was excluded by the use of the NK-sensitive cell line K 562. Additionally the specifity of the lysis was tested in cold-target-inhibition-51chromium-release-assays. Furthermore antibody blocking experiments were executed to demonstrate the HLA-A2 restriction of the reaction. To present these experiments finally in an autologous setting, DCs, generated from the identical PBMNCs that were used for CTL induction, were utilized as target cells. As an endogenous c-Met expression of these DCs was excluded before by using the Western Blotting method, the DCs were transfected with whole tumor RNA of a c-Met expressing cell line. This dissertation showed that the c-Met specific CTLs recognize and lyse efficiently c-Met expressing target cells in an heterologous as well as in an autologous setting in an antigen-specific and MHC-restricted manner. The recognition of the target cells was made by the application of tumor cells endogenously expressing the c-Met proto-oncogene as well as tumor cells pulsed with synthetic peptide and by the use of DCs transfected with whole tumor RNA. Furthermore it was demonstrated that various human epithelial and haematopoietic tumor cell lines, e.g. renal cell carcinoma, colon carcinoma, malignant melanoma, ovarial carcinoma, mamma carcinoma and multiple myeloma, express the c-Met oncogene. Consequently it was shown that the c-Met peptide expressed by several human tumor cell lines is a new tumor rejection antigene and can therefore be seen as an interesting candidate to be applied in immunotherapies against human malignancies. Nevertheless with the collected data in this dissertation a conclusion about the reachability of clinical success or resulting risks and side-effects is not possible. However it was demonstrated in several clinical vaccination trials using DCs which presented tumor-associated antigenes or using adoptive transfer of tumor-reactive CTLs generated ex vivo, that these approaches are able to induce antitumor immunity in patients with malignant diseases. Considerable clinical results were published, e.g. remissions for months even in progressed malignancies. As these clinical approaches have not been accompanied with severe side-effects or therapy-limiting autoimmuno phenomena yet, this dissertation might participate in extending the options for encouraging new therapies in the cure for malignant diseases.