Etablierung und Evaluierung einer vollautomatisierten Extraktionsmethode für DNA aus humanpathogenen Pilzen

Abstract

Die Anwendung von MagNA Pure LC (TM) und das entwickelte Protokoll zur Extraktion von Pilz-DNA erwies sich als schnelle, sensitive und reproduzierbare Methode zur molekularen Diagnostik invasiver Mykosen. Sie leistet damit einen Beitrag zur Standardisierung molekularer Nachweisverfahren von Pilzinfektionen. In dieser Arbeit wurde eine automatisierte Methode zur Extraktion von fungalen Nukleinsäuren entwickelt und an klinischen Proben evaluiert. Die Methode basiert auf dem Extraktionsautomaten MagNA Pure LC (TM) (Roche Diagnostics) und wurde zur Aufspaltung der rigiden Pilzzellwände durch die Anwendung von Glasperlen erweitert.

Mit dieser Methode konnte die DNA von insgesamt 23 verschiedenen Hefe- und Schimmelpilzen erfolgreich isoliert werden. Serielle Verdünnungen von Aspergillus fumigatus Konidien und Candida albicans Zellen (jeweils von 106 bis 100 CFU / ml) wurden zur Evaluierung der Sensitivität des Verfahrens eingesetzt. Außerdem wurde die DNA aus 68 klinischen Proben von 31 hämatologischen Patienten (57 Blutproben und 11 BALs), extrahiert und die PCR-Ergebnisse mit denen der manuellen, etablierten Methode verglichen. Die mit der neu entwickelten Methode isolierte DNA war reproduzierbar bis zu einem Detektionslimit von 101 CFU nachweisbar. Für C. albicans und in 9 / 28 Extraktionsläufen auch für A. fumigatus waren 100 CFU detektierbar. Insgesamt ist die Sensitivität der entwickelten Methode mit der des Routineprotokolls vergleichbar und ausreichend, um fungale DNA in Patientenblut, welches im Allgemeinen eine sehr geringe Pilzlast von 100 – 101 CFU aufweist, nachzuweisen. Die DNA aller 23 verwendeten Pilze konnte durch real-time PCR mit dem LightCycler Instrument (Roche Diagnostics) amplifiziert werden. Die Detektion des Amplifikats erfolgte durch spezifische LightCycler Sonden oder mittels anschließender Gelelektrophorese. Kontaminationen aus der Umgebung stellen bei der Extraktion von fungaler DNA ein wichtiges Problem dar. In der hier gezeigten Arbeit verblieben alle 43 mitgeführten Negativkontrollen negativ. Es traten keine Kontaminationsprobleme aus der Umgebung oder zwischen einzelnen Proben auf. Der Zeitaufwand für den molekularen Pilznachweis aus Blutproben konnte durch die Etablierung automatisierter Techniken auf drei Stunden reduziert werden. Das etablierte Protokoll hingegen nimmt allein zur DNA-Extraktion 7 Stunden in Anspruch. Insbesondere für immunsupprimierte Patienten mit Verdacht auf eine invasive Pilzinfektion ist eine schnelle Bestätigung der Diagnose und frühzeitige Therapieeinleitung für die Prognose von entscheidender Wichtigkeit. Die Materialkosten des entwickelten automatisierten Testverfahrens belaufen sich auf zirka vier Euro, was den Kosten für die manuelle Extraktion entspricht. Bei der automatisierten Methode ist jedoch der Personalaufwand erheblich geringer, was die Kosten senkt. Zur Evaluierung der neuen Methode wurden 68 Patientenproben parallel im Routineverfahren und durch den MagNA Pure LC (TM) Assay analysiert. In 63 Fällen stimmten die Ergebnisse überein. Fünf Proben, die im Routinetest positive Resultate für Aspergillus fumigatus oder für Candida albicans zeigten, verblieben im MagNA Pure LC (TM) jeweils negativ Assay. Bei einer retrospektiven Analyse der klinischen Daten und Testergebnissen aus der Medizischen Mikrobiologie und Virologie von den entsprechenden Patienten konnte in allen Fällen gezeigt werden, dass keine invasive Mykose vorgelegen hat.

In this thesis, an automated method for the extraction of fungal nucleic acids has been established. Additionally, the method has been evaluated using clinical specimens. The method relies on the extraction robot MagNA Pure LC (TM) (Roche Diagnostics) and has been expanded by an additional lysis step using glass beads to open the rigid cell walls of fungi. Using this method, nucleic acids from a total of 23 different yeast and mould species could be extracted successfully. Serial dilutions of Aspergillus fumigatus conidia as well as from Candida albicans cells (ranging from 106 to 100 CFU / ml each) have been used to evaluate the sensitivity of the assay. Furthermore, DNA from 68 clinical samples obtained from 31 haematology patients (57 blood samples and 11 BALs) has been isolated and the results were compared to those obtained by using the manual extraction method. The detection limit for DNA extracted by using the newly developed method was repeatedly found to be 101 CFU. In case of C. albicans, and in 9 out of 28 cases also for A. fumigatus, the lower detection limit was 100 CFU. After all, the sensitivity of the new protocol is comparable to the manual assay and sufficient to detect the small amounts of fungal DNA (100 - 101 CFU) usually present in infected patients' blood samples. DNA extracted from all 23 fungi used could successfully be amplified by real-time PCR using the LightCycler Instrument (Roche Diagnostics). Amplified sequences were either detected by specific LightCycler or by gel electrophoresis performed subsequently to the amplification process. Contamination resulting from the environment often causes difficulty when extracting fungal DNA. In this thesis all 43 negative controls run in parallel to the samples analysed remained negative. Neither environmental contamination nor cross contamination was observed. The time needed for the detection of fungal DNA in blood specimens could be reduced to a total of three hours using the automated method. In contrast to this, the manual method takes seven hours for DNA extraction alone. Especially in immunocompromised patients it is mandatory to verify a suspected invasive fungal infection early in the course of disease as early initiation of adequate therapy is crucial to the outcome of patients. The costs of the automated assay are about four Euros which is comparable to those of the manual extraction protocol. However, the human effort and 'hands on' time needed to perform the automated assay is much lower. Thus automation reduces the costs of the test. In order to evaluate the new assay, 68 specimens were analysed by the manual and the automated MagNA Pure LC (TM) protocol in parallel. In 63 cases congruent results were obtained. Five samples found positive for either C. albicans or A. fumigatus in the manual test remained negative in the MagNA Pure LC (TM) assay. Retrospective analysis of clinical and microbiological data from the patients concerned revealed that none of these patients had suffered from invasive fungal infection. The application of the MagNA Pure LC (TM) instrument combined with the extraction protocol for fungal DNA developed in the course of this thesis was found to be a rapid, sensitive and reproducible tool in molecular diagnosis of invasive fungal infection. Thus it contributes to the standardisation of molecular detection methods for fungi.