Modulation der Bindung von Sulfonylharnstoffen und KATP-Kanalöffnern an rekombinante Sulfonylharnstoffrezeptoren durch Lipide

Abstract

ATP-abhängige K+-Kanäle bestehen aus porenformenden Untereinheiten der Kir6.x-Familie und den Sulfonylharnstoffrezeptoren (SURs) als zusätzlichen (alpha)-Untereinheiten. Physiologisch werden diese Kanäle durch ATP-Bindung an die Kir6.2-Untereinheit geschlossen und durch MgATP-Bindung an SUR geöffnet. Die antidiabetischen Sulfonylharnstoffe schließen den Kanal; daneben gibt es aber auch synthetische Kanalöffner wie z.B. Diazoxid. Öffner und Schließer setzen am SUR an. Erst in den letzten Jahren hat man erkannt, dass Membranphospholipide wie PIP2 und langkettige Acyl-CoA Ester wie Oleoyl-CoA in physiologischen Konzentrationen die Nukleotidempfindlichkeit der KATP- Kanäle durch Interaktion mit der KIR6.2 Untereinheit reduzieren und somit den Arbeitspunkt der Kanäle einstellen. Pharmakologisch bedeutsam ist die Beobachtung, dass die Lipide gleichzeitig auch die Wirkung der Sulfonylharnstoffe und der Öffner aufheben; es wird angenommen, dass sie die Pore vom regulatorischen Einfluss der SUR Untereinheit entkoppeln. Man weiß jedoch nicht, ob die Lipide durch einen Ansatz am SUR direkt mit der Bindung der Kanalmodulatoren interferieren. Diese Frage sollte in dieser Arbeit geklärt werden. Dazu wurden Radioligandbindungsmessungen mit dem Öffner 3H-P1075 und dem Sulfonyl-harnstoff 3H-Glibenclamid (3H-GBC) an rekombinanten SURs durchgeführt. Die 3H-P1075 Bindung wurde an SUR2A (Herz) und SUR2B (glatter Muskel), die 3H-GBC Bindung an einer SUR2A-Mutanten mit hoher Affinität für GBC und SUR1 (betaBZellen des Pankreas und Neuronen) gemessen. Als Lipide dienten PIP2, sein Analogon DOGS-NTA (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-succinyl[N-(5-Amino-1-Carboxypentyl) Imino-Diessigsäure)]) und Oleoyl-CoA. Alle drei Lipide konnten die Bindung der Radioliganden hemmen. PIP2 erwies sich als schwacher Hemmstoff der 3H-P1075 Bindung an die SUR2 Subtypen (IC50 > 100 µM). DOGS-NTA war ein deutlich potenterer Hemmstoff der Radioligandenbindung; jedoch war die Hemmung auch bei Sättigung nicht vollständig. Dabei erwiesen sich die SUR2 Subtypen als empfindlicher als SUR1, sowohl was die Hemmkonstanten als auch das Ausmaß der Hemmung angeht. Oleoyl-CoA war der potenteste Hemmstoff der Bindung (IC50 Werte zwischen 12 und 65 µM); alle Hemmkurven erreichten 100 % und zeigten häufig Hillkoeffizienten >1. Völlig überraschend wurde eine Stimulation der 3H-GBC Bindung an die SUR2A Mutante durch niedrige Oleoyl-CoA Konzentrationen beobachtet (EC50 = 3 nM, Erhöhung 50 %); eine schwache aber signifikante Stimulation (7 %) der 3H-P1075 Bindung an SUR2A durch DOGS-NTA (1 µM) weist darauf hin, dass dieses Phänomen vielleicht allgemein bei niedrigen Lipidkonzentrationen auftritt. Dies konnte jedoch aus Zeitgründen nicht mehr untersucht werden. Diese Arbeit zeigt damit zum ersten Mal, dass die Lipide auch am SUR ansetzen können und die pharmakologischen Eigenschaften des SUR verändern. Die überraschende Stimulation der Glibenclamidbindung an SUR2A tritt bei physiologischen Konzentrationen von Oleoyl-CoA auf, steht aber im Gegensatz zu den elektrophysiologischen Effekten. Die Hemmung der Radioligandbindung tritt erst bei Lipidkonzentrationen auf, die 10 - 100-fach höher sind als die, die durch Angriff am KIR6.2 den Kanal modifizieren. Daher kann man dieser Hemmung wohl keine physiologische Bedeutung zusprechen.

ATP-dependent K+-channels consist of pore-forming subunits of the KIR6.x-family and of sulfonylurea receptors (SUR) as additional (alpha)-subunits. Physiologically, these channels are closed by binding of ATP to the KIR6.2-subunit and opened by binding of MgATP to SUR. The anti-diabetic sulfonylureas act by closing the channel; furthermore there are synthetic channel openers like diazoxide. Channel openers and closers bind to SUR. Over the past years we have learned that membrane phospholipids like PIP2 and long chain Acyl-CoA esters such as oleoyl-CoA reduce the nucleotide sensitivity of KATP-channels by interacting with the KIR6.2 subunit; hence they adjust the operating point of the channels. I is of pharmacological importance that these lipids also neutralize the effect of sulfonylureas and openers, presumably by uncoupling the pore from the regulatory influence of the SUR subunit. It is, however, not known whether the lipids directly interfere with the binding of the channel modulators to the SUR. This issue was addressed in the present work.

For this purpose, radioligand binding experiments using the opener 3H-P1075 and the sulfonylurea 3H-Glibenclamide (3H-GBC) as the radioligands and recombinant SUR were carried out. Binding of 3H-P1075 with SUR2A (heart) and SUR2B (smooth muscle) was measured as well as binding of 3H-GBC to a mutant of SUR2A with high affinity for GBC and to SUR1 (pancreatic beta-cells). PIP2, its analogue DOGS-NTA (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-succinyl [N(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid] and oleoyl-CoA were used as the lipids.

All lipids were able to inhibit the radioligand binding. PIP2 proved to be a weak inhibitor of the 3H-P1075 binding to SUR2 subtypes (IC50 > 100 µM). DOGS-NTA was definitely a more potent inhibitor; however the inhibition was not complete at saturation. Overall, the SUR2 subtypes came out to be more sensitive as SUR1 with respect to both the inhibition constant and the extent of inhibition. The most potent inhibitor of binding was oleoyl-CoA (IC50s in the range from 12 to 65 µM); in addition, all inhibition curves reached 100 % with Hill coefficient >1.

Surprisingly, a stimulation of 3H-GBC binding to SUR2A mutant was observed at low concentrations of oleoyl-CoA (EC50 = 3 nM, increase of 50%). In addition, a weak but significant stimulation (7%) of 3H-P1075 binding to SUR2A by DOGS-NTA (1 µM) was observed, suggesting that this phenomenon could be a general effect at low lipid concentrations. Due to lack of time, this problem (which was noticed only towards the end of the thesis) could not be elucidated. This work shows for the first time that lipids can affect SUR to change its pharmacological characteristics. The surprising stimulation of glibenclamide binding to SUR2A was observed at physiological concentrations of oleoyl-CoA; however it stands in sharp contrast to the neutralisation of the SU effects observed in electrophysiological experiments. The inhibition of radioligand binding started at concentrations 10-100x higher than those which decouple Kir6.2 from SUR by interacting with Kir6.2. Therefore the observed inhibition of radioligand binding to SUR is probably not of physiological relevance .