Etablierung und Evaluierung einer vollautomatisierten HCMV-DNA-Extraktionsmethode mittels MagNA Pure, quantitative Amplifizierung mittels COBAS Amplicor und klinische Anwendung in einer Phase I/II- Studie

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-14885
http://hdl.handle.net/10900/44565
Dokumentart: Dissertation
Date: 2004
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Sonstige
Advisor: Einsele, Hermann
Day of Oral Examination: 2004-11-10
DDC Classifikation: 610 - Medicine and health
Keywords: Cytomegalie-Virus , Polymerase-Kettenreaktion , Knochenmarktransplantation , Genamplifikation , Quantitative Analyse
Other Keywords: Vollautomatisierung , MagNA Pure , COBAS Amplicor , Stammzelltransplantation , Extraktion
COBAS Amplicor , MagNA Pure , fully automated , HCMV , PCR
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Inhaltszusammenfassung:

Die PCR gewinnt in der Medizin und insbesondere im Bereich der Routinediagnostik immer mehr Bedeutung. Für die Amplifikation und Detektion pathogenspezifischer Nukleinsäuren wurden mittlerweile zahlreiche automatisierte Systeme entwickelt. Die zuvor erforderliche Extraktion der Nukleinsäuren wird jedoch in den meisten Labors weiterhin von Hand durchgeführt, ist arbeits- und zeitaufwendig und stellt hohe technische Anforderungen an das Laborpersonal. Die Probenvorbereitung stellt heute in den meisten molekularen Assays die Schwachstelle dar. Die volle Automatisierung ist erforderlich, um menschliche Fehler zu vermeiden, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu verbessern, das Verfahren zu standardisieren und die Analyse größerer Probenzahlen zu ermöglichen. Ferner könnten Arbeitszeit und damit auch Kosten eingespart werden. In dieser Arbeit wurde die Nukleinsäurenextraktion mittels des MagNA Pure LC Systems mit der quantitativen PCR im COBAS Amplicor verknüpft, um einen vollautomatisierten DNA-Nachweis von humanen Cytomegalieviren zu ermöglichen. Um die Kompatibilität der beiden Systeme und die Vergleichbarkeit der Extraktion im MagNA Pure LC mit der Handextraktion zu belegen, wurden im Direktvergleich parallel 90 klinische Proben analysiert. Ferner wurden im vollautomatisierten Protokoll Verdünnungsreihen getestet. Dabei wurde deutlich, dass die Extraktion im MagNA Pure nur etwa halb so effizient ist, wie die Handextraktion. Auf die ermittelten Viruslasten hatte das aber keinen Einfluss, die Ergebnisse zeigten eine gute Übereinstimmung. Sensitivität, Spezifität, Reproduzierbarkeit und Linearität des vollautomatisierten Verfahrens waren dabei absolut vergleichbar mit der konventionellen Methode. Ferner konnte, bei geringen zusätzlichen Kosten pro Probe, für die erforderliche Handarbeit ein enormer Zeitgewinn erzielt werden. Außerdem wurden in einer kleinen klinischen Studie im Rahmen der antiviralen präemptiven Therapie nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation 262 Patientenproben analysiert. Die gute Eignung des vollautomatisierten Verfahrens für die Routinediagnostik konnte diesbezüglich gezeigt werden.

Abstract:

The PCR gains more and more importance in medicine, especially for routine diagnostics. For the amplification and detection of pathogen specific nucleic acids numerous automated systems have been developed by now. The beforehand needed extraction of nucleic acids, still carried out manually in most laboratories, is labour-intensive, time-consuming and makes high demands on laboratory staff. Today the sample preparation represents the weak point in most molecular assays. The entire automation is essential to avoid human errors, to improve exactness and the possibility to reproduce the results, to standardize the method and to allow the analysis of clinical samples in large numbers. Further working hours and included costs could also be reduced. In this study the purification of nucleic acids using the MagNA Pure LC system was combined with a quantitative PCR using the COBAS Amplicor to allow a fully automated detection method for human cytomegalovirus. To verify the compatibility of both systems and to show the extraction by MagNA Pure LC to be equivalent with the manual extraction, 90 clinical specimens were analized parallel for direct comparison. Besides dilution rows were tested in the fully automated assay. As a result the extraction using the MagNA Pure was found out to be only half efficient compared with the manual extraction. This showed no influence on the determined viral loads, the results demonstrated a good conformity. Sensitivity, specifity, reproducibility and linearity of the fully automated assay were absolutely comparable to the conventional method. Concerning the necessary hands-on time an enormous saving could be achieved, with low additional costs per sample. Besides 262 patient specimens were analized in a small clinical study in the course of the preemptive antiviral therapy after hematopoietic stem cell transplantation. Therefore the good aptitude of the fully automated assay for the routine diagnostics could be demonstrated.

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