Natriumsalz der Monochloressigsäure: Wirkung auf Nierenzellen des Menschen unter besonderer Berücksichtigung der Cathepsin-Aktivitäten

Abstract

Die vorliegende experimentelle Arbeit untersucht neben der akuten Toxizität des Gefahrstoffs Natriummonochloracetat (Na-MCA) auch dessen biochemischen Wirkmechanismus an konfluenten und proliferierenden Nierenzellen des Menschen durch Bestimmung der Cathepsin-Aktivitäten. Hierfür wurden A-498-Zellen (kontinuierliche Zelllinie, etabliert aus dem Nierenzellkarzinom eines 52-jährigen Mannes) 24 Stunden lang mit Na-MCA in Konzentrationen bis 400 µg/ml inkubiert und für die Bestimmung der Cathepsin-Aktivitäten zu Gesamtzell-Lysaten bzw. Organellen-Fraktionen aufbereitet. Na-MCA, das Natriumsalz der Monochloressigsäure, ist ein arbeitsmedizinisch relevanter Gefahrstoff mit großer industrieller Bedeutung als Ausgangsprodukt für vielfältigste chemische Synthesen. Cathepsine sind als lysosomale Cysteinproteasen für einen Großteil der intrazellulären Proteolyse verantwortlich und werden extralysosomal durch Cysteinproteasen-Inhibitoren (CPIs) gehemmt. Nierenzellen - Orte stärkster Na-MCA-Anreicherung in der ersten Zeit nach Na-MCA-Resorption - enthalten in ihren sehr zahlreichen Lysosomen besonders hohe Konzentrationen der Cathepsine B, L und S.

Ergebnisse: Konfluente A-498-Zellen (Schwerpunkt dieser Studie) zeigten in weitgehend CPIs-freien Organellen-Fraktionen (Anreicherung von Lysosomen und damit Cathepsinen) eine dosisabhängige Abnahme ihrer Cathepsin-Aktivitäten durch Na-MCA, wobei die Cathepsin B-Aktivität am stärksten und die Cathepsin S-Aktivität am wenigsten abfiel. Dies deutet hin auf unterschiedliche Na-MCA-Sensitivität der Cathepsine B, L und S mit höchster Empfindlichkeit des Cathepsin B und geringster des Cathepsin S. Auch in den CPIs-reichen Gesamtzell-Lysaten ließ sich dieser dosisabhängige Aktivitätsrückgang durch Na-MCA beobachten, der aber insbesondere für die Cathepsine L+S sehr viel schwächer ausfiel als in den Organellen-Fraktionen. Dies weist hin auf eine Na-MCA-induzierte Wirkungsabschwächung cytosolischer CPIs, deren Effekte auf die Cathepsine L und S bekanntlich stärker sind als auf Cathepsin B - wie auch in vorliegender Arbeit gezeigt werden konnte. Proliferierende A-498-Zellen - welche unabhängig von der Na-MCA-Dosis in Relation zur Cathepsin B-Aktivität höhere Cathepsin L+S-Aktivitäten aufwiesen als konfluente A-498-Zellen - wurden hingegen durch Na-MCA (zumindest bis 200 µg/ml) kaum in ihren Cathepsin-Aktivitäten beeinträchtigt; in Vitalität und Proteingehalt dagegen weit stärker als konfluente A-498-Zellen. So reagierten proliferierende A-498-Zellen schon auf geringere Na-MCA-Konzentrationen hypertrophisch (deutbar als Folge einer Na-MCA-induzierten metabolischen Azidose) und zunehmend nekrotisch (Wiederabnahme des Zellproteins bei höheren Na-MCA-Konzentrationen) und wurden durch 200 µg/ml Na-MCA nahezu 40 mal stärker geschädigt als konfluente A-498-Zellen.

This experimental thesis investigates not only the acute toxicity of sodium monochloroacetate (SMCA) but also its biochemical mode of action in confluent and proliferating human renal cells by determination of their cathepsin activities. For this, A-498 cells (permanent cell line established from the kidney carcinoma of a 52-year-old man) were incubated with SMCA at concentrations up to 400 µg/mL for 24 hours and then prepared for the determination of their cathepsin activities by hypotonic lysis (whole cell lysates) resp. subcellular fractionation (organelle fractions). SMCA, the sodium salt of monochloroacetic acid, is a hazardous substance widely used in chemical industries as synthesis intermediate and therefore highly relevant in industrial medicine. Cathepsins, lysosomal cysteine proteases, are responsible for the major part of intracellular proteolysis and are inhibited by cysteine protease inhibitors (CPIs) when outside lysosomes (i. e. in pathological conditions such as inflammation and tumor). Kidney cells show highest concentrations of SMCA at earlier time periods after resorption and their numerous lysosomes contain particularly high amounts of the cathepsins B, L and S.

Findings: In their organelle fractions (enrichment of lysosomes and therewith cathepsins) - which are largely free of CPIs - confluent A-498 cells (emphasis of this study) showed a dose-dependent decrease of their cathepsin activities caused by SMCA, with stronger decrease of cathepsin B activity and weaker decrease of cathepsin S activity. This suggests different sensitivities to SMCA for the three cathepsins B, L and S with highest sensitivity of cathepsin B and lowest sensitivity of cathepsin S. A dose-dependent decrease of cathepsin activities due to SMCA was also found in whole cell lysates which are rich in CPIs; but for the cathepsins L+S this decrease was much attenuated compared to the one in organelle fractions. This indicates an SMCA-induced weakened effectiveness of cytosolic CPIs whose effects on the cathepsins L and S are stronger than on cathepsin B - as once more shown in the present study. Proliferating A-498 cells - which showed relatively (in relation to their cathepsin B activity) higher cathepsins L+S activities than confluent cells, and that for all SMCA concentrations tested - however were hardly impaired by SMCA as to their cathepsin activities, but much more impaired than confluent cells as far as their vitality and protein content is concerned. Thus proliferating cells already react to lower concentrations of SMCA with hypertrophy (explicable as a result of SMCA-induced metabolic acidosis) and increasingly with necrosis (re-decrease of cell protein in higher SMCA concentrations), and their impairment upon 200 µg/mL SMCA was almost 40 times that of confluent A-498 cells.