Optimierung eines vollautomatisierten, PCR-basierten Nachweisverfahrens von DNA aus humanpathogenen Pilzen

Abstract

Zielsetzung dieser Arbeit war die Optimierung neuer vollautomatisierter Testverfahren für die Extraktion, Amplifikation und Detektion von Nukleinsäuren aus humanpathogenen Pilzen. Insgesamt wurden 152 Vollblutproben von insgesamt 38 Patienten auf die Präsenz von Aspergillus DNA untersucht. Die Untersuchung beinhaltete die Extraktion fungaler DNA mit dem MagNA Pure LC Extraktionsautomaten und die anschließende Amplifikation und Detektion mit dem real-time PCR LightCycler Instrument. Parallel wurden die Nukleinsäuren manuell mit Qiagen extrahiert, mit der PCR - ELISA Methode amplifiziert und detektiert, und anschließend die Ergebnisse miteinander verglichen. 24 Proben von 11 Patienten konnten mit Qiagen und PCR - ELISA Aspergillus positiv getestet werden. Dem gegenüber konnten 3 Proben von 3 Patienten mit der Kombination MagNA Pure - LightCycler positiv getestet werden. Da das Erregerspektrum der invasiven Mykosen ständig zunimmt, wurde in diesem Zusammenhang der Extraktionskit MagNA Pure LC DNA Isolation Kit II für die Extraktion von DNA verschiedener Pilze evaluiert. Die Evaluierung erfolgte anhand verschiedener Sensitivitäts-, Reproduktions- und Kontaminationsversuche, wobei unter anderem auch die Notwendigkeit einer vorbereitenden Zellwanddisruption mit Glaspartikeln (glass beads) bewiesen werden konnte. In diesem Zusammenhang wurde eine Methode zur Homogenisierung und damit zur Extraktionsvorbereitung von murinen Gewebestücken (Herz, Lunge, Niere, Milz) mit dem FastPep Instrument evaluiert und etabliert. Dadurch ist es fortan möglich, aus humanen Biopsaten hochreine DNA sensitiv und effizient zu extrahieren. Anhand verschiedener Auftauversuche konnte bei unterschiedlich langer Lagerung bei minus 20° C gezeigt werden, dass die extrahierten fungalen Nukleinsäuren keinen Schaden nehmen. Eine Aufbewahrung über einen längeren Zeitraum erscheint also problemlos möglich. Um jedoch letztendlich eine sichere und alleinige Anwendung der automatischen Nukleinsäureextraktion und Detektion in der Diagnostik invasiver Mykosen gewährleisten zu können, besteht aufgrund des im Untersuchungszeitraumes zu geringen Patientenkollektivs die Notwendigkeit, die gewonnenen Ergebnisse in künftigen Arbeiten auf größere Patientenkollektive zu übertragen.

The aim of this thesis was the optimazation of fully automated essays for the etraction, amplification and detection of DNA from human pathogenic fungi. In total, 152 whole blood samples from 38 patients were analyzed for the presence of aspergillus DNA. This included the extraction of fungal DNA with the MagNA Pure LC instrument followed by amplification and detection using the Light Cycler real Time PCR-machine. In parallel, DNA was extracted manually by using Qiagen spin collums followed by conventional PCR amplification.There after, results of both mehods were compared with each other. 24 samples from 11 patients were found to be positive for aspergillus DNA by using the Qiagen and ELISA - methods where as only 3 samples from 3 patients were found to be positive by MagNA Pure and Light Cycler. Due to the fact that the incidence of invasive mycosis is steadily increasing, the fungus-specific MagNA Pure LC DNA isolation Kit II was also evaluated. Different sensitivity, reproducibility and contmination essay were evaluated. Additional tests showed that for fungal cell wall destructiopn the use of glass beads is essential. Furthermore, a method for the homogenisation of murine biopsies (heart, lung, kidney and spleen) was evaluated and established by using the FastPrep instrument. In consequence, it is now possible to extract sensitivly and efficiently highly purified DNA from human biopsies. Freezing at -20° C for different time periods revealed that fungal DNA was still intact. This shows that storage of fungal DNA at -20° C is possible without loss of sensitivity. However, for a final decision if fully automated extraction and detection of fungal DNA might be beneficial, furhter studies with larger patient cohorts are mandatory.