Einfluß chronischer Endothelinstimulation auf glatte Gefäßmuskulatur und Herzmuskulatur – Veränderungen der Proteinkinase C

Abstract

Die Haupttodesursache in westlichen Gesellschaften stellen Krankheiten des Gefäßsystems und des Herzens dar. Diesen Krankheiten liegt eine Arteriosklerose zugrunde, die mit einer arteriellen Hypertonie vergesellschaftet sein kann. Sie können dann in eine chronische Herzinsuffizienz münden. Bei diesen Erkrankungen scheint das Endothelinsystem eine große Rolle zu spielen, denn es akkumuliert bereits im Anfangsstadium dieser Krankheiten massiv in den Gefäßen. Der Umfang dieser ET-1-Konzentrationserhöhungen korreliert dabei positiv mit dem Schweregrad der Krankheitsausprägung und somit mit der Prognose der einzelnen Patienten. Die Proteinkinase C (PKC) stellt hierbei ein sehr wichtiges Schlüsselenzym dar. Bei der PKC werden multiple Isoformen unterschieden, unter anderem die PKC-alpha, PKC-delta, PKC-epsilon und die PKC-zeta. Bekannt ist, daß die Kurzzeitinkubation von Zellkulturen mit ET-1 zu einer quantitativen Zunahme der PKC-Isoformen führt. Es ist jedoch nicht bekannt, ob bei langfristig erhöhten ET-1-Konzentrationen ebenfalls differenzierte Veränderungen der PKC-Isoformen beobachtbar sind. Eine Untersuchung dieser Frage ist von Relevanz, da erhöhte PKC-Konzentrationen bei chronisch erhöhtem ET-1 kardiale und vaskuläre Krankheiten wesentlich mitverursachen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher der Einfluß einer permanenten Stimulation von glatten Gefäßmuskelzellen in vitro und Herzmuskelzellen in vivo mit ET-1 am Rattenmodell auf die PKC untersucht. Neue Erkenntnisse konnten durch die Durchführung quantitativer Western-Blots gewonnen werden. Mit der Aktivierung der PKC kommt es zu einem Wechsel der Lokalisation der PKC. Diese wurde mittels Immunfluoreszenz-Versuchen analysiert. Die relativen Proteinkonzentrationen der PKC-alpha und der PKC-epsilon in A-10-glatten-Muskelzellen steigen bei chronischer 96-stündiger Inkubation der Zellen mit ET-1 bis zu einem Maximum von 243 % für die PKC-alpha und 339 % für die PKC-epsilon, wohingegen die Konzentration der PKC-zeta konstant bleibt. Bei der PKC-epsilon läßt sich in der Immunfluoreszenz keine Translokation in den Zellkern und somit wahrscheinlich auch keine Aktivität nach mehrstündiger ET-1-Inkubation feststellen. Eine Translokation und damit wahrscheinlich auch eine Aktivierung läßt sich erst durch Zugabe von AT-II nach 15 Minuten erreichen. Bei Ratten läßt sich nach vierwöchiger Infusion von ET-1 ein Anstieg der Konzentrationen der PKC im Myokardgewebe feststellen, und zwar bei der PKC-alpha auf 167,0 %, bei der PKC-delta auf 123,8 % und bei der PKC-epsilon auf 162,3 % feststellen, wohingegen die Konzentration der PKC-zeta praktisch konstant bleibt (91,4 %). Die vorliegenden Daten schlagen somit eine Brücke zwischen quantitativer Erhöhung der PKC bei chronischer Erhöhung der ET-1-Konzentrationen und der Pathogenese von Hypertonie, Atherosklerose und chronischer Herzinsuffizienz. Unter der Stimulation mit ET-1 steigen die PKC-Isoformen in Zellen an, verbleiben jedoch bei längerfristig erhöhtem ET-1 im Zytoplasma, sind also nicht in den Kern transloziert. Dies macht eine Aktivierung wenig wahrscheinlich. Durch Zugabe von Angiotensin-II jedoch ist die Translokation der gesamten PKC-epsilon, also auch der Fraktion, die unter dem Einfluß von ET-1 gebildet wurde, in den Zellkern beobachtbar, so daß eine Aktivierung der PKC zu vermuten ist. Ähnliche Prozesse könnten auch in vivo stattfinden. Langfristig erhöhte ET-1-Konzentrationen führen zur erhöhten intrazellulären PKC-Konzentrationen, die beispielsweise durch AT-II vollständig transloziert und damit wahrscheinlich auch aktiviert werden und somit die Entwicklung von Hypertonie, Atherosklerose und Herzinsuffizienz fördern. Nach den vorliegenden Daten läßt sich schlußfolgern, daß daß eine Blockade des Endothelinsystems wahrscheinlich sehr frühzeitig erfolgen muß, ET-1 bereits in der Frühphase der Arteriosklerose erhöht ist und hier adaptive Prozesse initiiert.

Cardial and vascular diseases are the main reason for death in western societies. Starting point of those diseases is an atherosclerotic change of the vascular structure that can be related with hypertension. This can cause chronic heart failure, too. A major actor in that development seems to be the endothelin system as it is activated even in early states of those diseases. The dimension of accumulation of ET-1 correlates with the severeness of the change and with the prognosis of the actual patient. Protein kinase C (PKC) represents a key enzyme in this process. There are several different isozymes of PKC, e. g. PKC-alpha, PKC-delta, PKC-epsilon and PKC-zeta. It is already known that a short time incubation of cells with ET-1 causes a significant quantitative raise of PKC-isozymes. However, it is not known if a chronically raised concentration of ET-1 also causes changes of the PKC isozymes. An investigation is of importance as chronically raised concentrations of PKC because of high concentrations of ET-1 could possibly contribute to an initiation and progression of cardial and vascular diseases. This paper investigates the impact of a chronical stimulation of smooth muscle cells in vitro and heart muscle cells in vivo on PKC isozymes. New findings could be gained by quantitative western blotting. As an activation of PKC is combined with a change of localisation findings of activity could be gained by immunofluorescene. The relative proteine concentrationof PKC isozymes in smooth muscle cells reach a maximum of 243% (PKC-alpha) respectively 339% (PKC-epsilon) after 96 hours of chronical incubation with ET-1, whereas the concentration of PKC-zeta seems to remain unchanged. PKC-epsilon doesn’t show any translocation into the nucleus in immunofluorescence experiments and thus probably no activation either after a long time incubation with ET-1. However, a translocation and thus probably an activation of PKC is shown after addition of Angiotensine-II after 15 minutes. Rat myocardial cells show significant raise of PKC-alpha (167%), PKC-delta (123%) and PKC-epsilon (162%) after four weeks of ET-1-infusion whereas the concentration of PKC-zeta doesn’t change any significant change (91%). These data build a bridge between the quantitative raise of ET-1-blood-concentrations and raised concentrations of PKC and the pathogenesis of cardial and vascular diseases. Chronically raised blood concentrations of ET-1 cause a raise of PKC-concentrations in vascular smooth muscle cells and cardiac muscle cells. However, these PKC enzymes remain in the cytoplasmatic area, an aspect that shows an activation of PKS to be unlikely. An addition of Angiotensine-II causes a complete translocation of PKC-epsilon into the nucleus, i.e. even of that part of PKC that has been produced because of the long term incubation with ET-1, an aspect that shows an activation of PKC to be likely. Similar proceedings could happen in vivo. Long time raise of ET-1 blood concentrations could cause a raise of intracellular PKC that could be translocated and activated by other hormons such as Angiotensine-II and thus contribute to the initiation and progress of diseases such as hypertension, atherosclerosis and heart failure. Thus, a blockade of the endothelin system obviously has to be made as early as possible to prevent changes in vascular and cardial structure to proceed.