Zytokinprofil regenerierender T-Zellen nach Transplantation von allogenen, CD34+ angereicherten, peripheren Blutstammzellen im Kindesalter

Abstract

Das Ziel dieser Studie war die Charakterisierung der T-Zell-Regeneration von 22 Patienten nach verwandter und nichtverwandter CD34+ angereicherter PBSZT. In einem ersten Schritt wurde die T-Zell-Regeneration nach PBSZT mittels FACS-Analyse anhand des Phänotyps der Zellen charakterisiert. Hierbei zeigte sich ein Überwiegen der CD45RO+ Gedächtniszellen zu frühen Zeitpunkten der Regeneration, was die Thymus-unabhängige, periphere Expansion reifer T-Zellen des Transplantats widerspiegelte. Im weiteren Verlauf stiegen im Rahmen der Thymus-abhängigen Regeneration die naiven, CD45RA+ T-Zellen kontinuierlich an. In einem weiteren Schritt wurde die Funktion der regenerierenden T-Zellen dargestellt. Die Lymphozyten derselben Patienten wurden mit den Mitogenen PMA und Ionomycin stimuliert und die produzierten Zytokine mittels ELISA quantifiziert. Von den hier untersuchten THI/TCI-Zytokinen IL-2 und IFN-γ wurde früh nach Transplantation hauptsächlich IFN-γ synthetisiert. Später überwog die IL-2-Synthese, während gegen Ende des Beobachtungs-zeitraums IFN-γ das am meisten produzierte Zytokin war. Die TH-2-Zytokine IL-4 und IL-10 wurden nur zu geringem Ausmaß synthetisiert. Um eine Zuordnung der produzierten Zytokine zu erhalten, wurden die stimulierten, zytokinproduzierenden Zellen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen charakteristische Oberflächenmoleküle und gegen intrazelluläre Zytokine angefärbt. Hier fiel im Vergleich zu den Lymphozyten der gesunden Kontrolle eine deutlich reduzierte Expression des Aktivierungsmarkers CD69 auf, die im weiteren Verlauf zunahm. Sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen produzierten alle untersuchten Zytokine, verglichen mit der gesunden Kontrolle jedoch in reduziertem Ausmaß. Die CD4+ Zellen waren in höherer Konzentration für IL-2 als für IFN-gamma positiv. Bei den CD8+ Zellen war das Verhältnis umgekehrt. Die defiziente Zytokinsynthese wurde mit dem Aktivierungsdefekt der T-Zellen in Zusammenhang gebracht, wofür, wie im Folgenden diskutiert, eine Vielzahl an Ursachen möglich sind.

The aim of the present study was a characterization of immune reconstitution after CD34+ enriched PBSCT from related and unrelated donors. Regenerating T cells in 22 patients were analyzed during the first 18 months posttransplantation. In a first step T cell regeneration after PBSCT was phenotypically described and quantified by FACS-analysis. The result was a predominance of CD45RO+ memory cells in early phase of regeneration reflecting the thymus-independent peripheral expansion of mature T cells of the graft. During the follow-up naïve thymus-derived CD45RA+ T cells were increasing constantly. In a further step the function of the regenerating T cells was analyzed. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of the same patients were stimulated with PMA and Ionomycin. After isolating the supernatant the produced amount of cytokines was quantified by ELISA. Regarding the measured TH1/TC1-cytokines, mainly IFN- was synthesized in the early posttransplantation phase. 6 months after transplantation IL-2 synthesis predominated, whereas at the end of the observed intervall of time the mainly produced cytokine was IFN-. The TH2/TC2-cytokines IL-4 and IL-10 were secreted in a small amount. Compared with T cells of a healthy person the production of all cytokines was substantially reduced. Furthermore the secretion of cytokines in different T lymphocyte subpopulations was evaluated. Stimulated PBMCs were simultaneously incubated with monoclonal antibodies against surface marker epitopes and intracellular located cytokines. The amount of T cell activation was measured by expression of CD69. In comparison with PBMCs of a healthy control CD69 was distinctly reduced during the follow-up, although its expression was constantly increasing. Both, CD4+ and CD8+ T cells produced all measured cytokines, but compared with the healthy control this happened in a substantially reduced amount. CD4+CD45RA+ cells secreted more IL-2 than IFN-gamma. In the CD8+CD45RO+ cells this relation was vice versa. In summary a substantial functional deficiency of regenerating T cells could be demonstrated. This was manifested in a decreased T cell activation which resulted in a reduced synthesis of cytokines. The causes of this functional defect are discussed in the following.