Entwicklung eines ELISA-basierten Neutralisationstests zur Untersuchung der CMV-spezifischen Immunantwort stammzelltransplantierter Patienten nach adoptivem Immuntransfer

Abstract

Die Bestimmung der Konzentration neutralisierender Antikörper gegen das menschliche Cytomegalovirus (HCMV) erfolgt üblicherweise durch Mikroneutralisationstests. Die Auswertung solcher Neutralisationstests erfolgte bisher durch immunzytochemische Färbung viraler Antigene und Auszählung der infizierten Zellen am Lichtmikroskop. Dieses Verfahren ist sehr zeitaufwendig und das Ergebnis ist in großem Maße von der Erfahrung des jeweiligen Untersuchers abhängig. Daher sollte ein ELISA-basierter Mikroneutralisationstest entwickelt werden, der eine objektivere Auswertung des Neutralisationstests ermöglicht, da eine automatische Bestimmung der Extinktion durch den EIA-Reader erfolgt. Der erste Schritt war die Optimierung der Zellkultur-, Infektions-, und Neutralisations- und Fixationsbedingungen zur Durchführung des Neutralisationstests. Zur Optimierung des ELISA wurden dann die Viruskonzentration sowie die Konzentration von Primär- und Sekundärantikörper variiert. Daraufhin wurden die Korrelation der mit ELISA und immunzytochemischer Färbung gewonnen Ergebnisse und die Reproduzierbarkeit des ELISA getestet. Der so entwickelte ELISA-basierte Neutralisationstest erwies sich als verlässlich und ist zudem mit einem wesentlich geringeren Zeitaufwand verbunden. Nach Etablierung des ELISA-basierten Neutralisationstests wurde nun seine Anwendbarkeit auf eine aktuelle Fragestellung getestet. Hierzu wurde untersucht, ob es Hinweise darauf gibt, dass es nach einem adoptivem T-Zell-Transfer zur Therapie einer HCMV-Infektion nach allogener SZT bei zusätzlicher Übertragung von CD4+ T-Zellen zu einer Steigerung der relativen Neutralisationskapazität kommt. Ebenso war interessant, ob eine hohe Neutralisationskapazität mit einem günstigeren klinischen Verlauf der HCMV-Infektion einhergeht. Diese Fragen wurden durch Messung der Neutralisationskapazität von Patientenseren im Verlauf untersucht. Es wurde beispielhaft die Neutralisationskapazität der Seren von fünf Patienten getestet, jeweils zum Zeitpunkt des T-Zell-Transfers sowie einen, zwei und drei Monate nach Transfer. Bei den hier durchgeführten Untersuchungen konnte kein Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen dem zusätzlichen Transfer CD4+ T-Zellen und dem Ausmaß der neutralisierenden Immunantwort gefunden werden. Das Serum eines Patienten unterschied sich von den übrigen dadurch, dass es gegen den Standard-HCMV-Stamm AD169 keine neutralisierende Aktivität zeigte. Bei Testung des Serums mit dem HCMV-Stamm Towne und dem patienteneigenen Virus-Isolat konnte allerdings eine sehr hohe Neutralisationskapazität nachgewiesen werden. Diese Eigenschaft lässt sich durch die stammspezifische Neutralisation von HCMV erklären. Für die These, dass eine Erhöhung der relativen Neutralisationskapazität mit einer besseren Elimination der HCMV-Infektion einhergeht, fand sich kein Anhaltspunkt. Aufgrund der kleinen Fallzahl müssen die erhaltenen Ergebnisse allerdings im Rahmen von Studien mit deutlich höheren Patientenzahlen überprüft werden.

Measurement of the concentration of neutralizing antibodies against the human cytomegalovirus (HCMV) is usually done employing micro-neutralisation tests. The readout of neutralisation tests hitherto resulted from a immuno-cytochemical staining of viral antigens and counting of the infected cells using a light-optical microscope. This procedure is very time-consuming and the result is highly dependend on the experience of the investigator. Thus an ELISA-based micro-neutralisation test should be developed in order to allow an objective analysis of the neutralization test due to the fact that the extinction is quantified automatically by an ELISA-reader. The first step was optimizing the conditions of cell culture, infection and neutralization for the performance of the neutralization test. Further-on, different fixation methods were tested. For optimization of the novel ELISA the following parameters were studied: concentration of virus, concentration of primary antibodies and concentration of secondary antibodies. Thereupon the correlation inbetween the results aquired by ELISA and by conventional immunocytochemical staining was analysed. The newly developed ELISA-based neutralization test was found to be highly reliable and significantly less time consuming. After the establishment of the ELISA-based neutralization test the applicability of the test in a clinical situation was investigated. It was studied whether there is evidence that inclusion of CD 4+ T-cells in an adoptive T-cell transfer for treatment of HCMV infection after allogenic stem-cell transplantation results in an increase in relative neutralization capacity. In addition it was analyzed whether an increase in relative neutralization capacity is associated with a favourable clinical course of HMCV infections. This problem was investigated functionally by measuring the relative neutralization capacitiy of patient sera in the course of HCMV infections. The relative neutralization capacity of sera of five patients was tested exemplary at the date of the T-cell transfer, and subsequently one month, two months and three months after transfer. The results revealed no evidenve of a correlation between the additional transfer of CD 4+ T-cells and the extent of the neutralizing immune answer. The serum of one patient differed from the other sera by the fact that it showed almost no neutralizing activity against the standard HCMV-strain AD169. Testing this serum with HCMV-strain Towne and the patient´s own viral strain, however, revealed a very high neutralizing activity. This feature could be explained with the strain specific neutralizing capacity of HCMV. In this analysis no indication could be found for the assumption that an increase of the relative neutralizing capacity is associated with a more effective elimination of HCMV-infections. Because of the small number of investigated patients the obtained results have to be verified in trials with explicitly larger numbers of patients.